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周雍进团队：动态强化毕赤酵母同源重组，实现基因组精准编辑且不影响细胞生长

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2025-03-18 11:41

上海

来源：澎湃新闻·澎湃号·湃客

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生命科学

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2025年3月11日，中国科学院大连化学物理研究所周雍进研究员团队在Cell Press细胞出版社期刊Trends in Biotechnology上发表题为“Inducible regulating homologous recombination enables precise genome editing in Pichia pastoris without perturbing cellular fitness”的研究论文。

他们在巴斯德毕赤酵母中建立了基因诱导表达系统，用于强化同源重组过程，提高基因组编辑准确度。该研究可以为其它非常规酵母的基因编辑效率强化提供全新的调控策略，同时也为巴斯德毕赤酵母高效利用甲醇合成高附加值产物的工业生产提供优势底盘菌株。

文章亮点

在微生物细胞工厂构建过程中，强化同源重组是提高基因组编辑效率的重要手段，然而，传统利用组成型启动子强化同源重组会带来细胞压力，影响细胞生产性能。本工作在巴斯德毕赤酵母中构建了Tet-On诱导系统并表达同源重组相关基因，该策略不会对细胞生长代谢带来负担，为毕赤酵母甲醇生物转化的细胞工厂提供优良底盘菌株。

在毕赤酵母细胞中建立了来源于E.coli的可受脱水四环素（aTc）诱导激活的TetR/tetO2系统（Tet-On），并成功利用内源组成型启动子PGAP为骨架构建了包含16个不同诱导激活强度的启动子库，为毕赤酵母调控基因表达提供更多启动子调控元件。

利用Tet-On诱导型启动子强化细胞同源重组修复途径关键基因RAD52和MUS81-MMS4的表达，并在CRISPR-Cas9基因编辑过程中添加诱导剂aTc激活同源重组修复途径，可使染色体单基因和多片段精准编辑阳性率达到80%以上，为提高非模式生物同源重组修复效率提供编辑策略。

图1：毕赤酵母诱导强化同源重组基因编辑工具的开发和应用。

文章简介

近年来，随着“碳达峰、碳中和”目标的提出，以CO2、甲烷、甲醇和甲酸等一碳资源作为生物炼制原料的方式日益受到关注，我国科学家更是利用太阳能驱动CO2还原技术（“液态阳光”）大规模制取甲醇，使甲醇成为重要的生物炼制原料之一。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris，又名Komagataellaphaffii）是一种非传统甲基营养型酵母，可以利用甲醇为唯一碳源生长，被视为实现甲醇高效转化的理想宿主。然而，构建高效微生物细胞工厂不仅需要优化生物合成途径以及重构细胞代谢，同样亟需高效精准的基因操作工具。

CRISPR-Cas9是现有最高效、简便的基因编辑和基因修饰技术之一，已成为最主流的基因编辑系统。在毕赤酵母中，DNA修复机制主要依靠非同源末端连接方式（NHEJ），不仅基因编辑效率低，还会造成碱基的突变、插入或缺失。目前，利用组成型启动子强化同源重组（HDR）修复途径关键基因RAD52的表达可以提高基因的精准编辑效率，但过度强化HDR可能带来细胞重组机制紊乱，给细胞生长和产物合成带来压力，限制了毕赤酵母细胞工厂的改造和产物的高效生产。

本研究通过在毕赤酵母细胞中引入来源于E.coli细胞的四环素诱导表达系统(TetR/tetO2)，并在内源组成型启动子PGAP的核心区域插入tetO2操纵子序列建立了可受脱水四环素 (aTc) 激活的启动子G2，并以此为基础进一步建立了激活强度不同的Tet-On诱导型启动子库，从而实现HDR相关基因的诱导激活（图2）。

图2：毕赤酵母Tet-On诱导型启动子库构建。（A）Tet-On诱导型启动子工作原理；（B）PGAP启动子tetO2操纵子序列插入位点筛选；诱导型启动子在20 g/L葡萄糖（C）和 10 g/L甲醇（D）培养基中的eGFP激活表达；（E）诱导型启动子库构建示意图；（F）Tet-On诱导型启动子库eGFP荧光激活强度。

该诱导强化基因编辑系统通过Tet-On启动子过表达同源重组关键基因RAD52，并在CRISPR-Cas9基因编辑操作过程中平板筛选阶段添加诱导剂aTc实现对Tet-On启动子的激活表达，结果对GUT1基因的敲除阳性率可达80%以上，进一步利用不同强度Tet-On诱导型启动子过表达多片段重组调控关键基因，发现MUS81-MMS4的过表达可提高多片段基因在细胞中的重组阳性率达到81%；最终，利用该诱导强化同源重组系统的底盘菌株进行改造，工程菌株不仅可以在20g/L甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，且脂肪醇产量也比组成型强化同源重组菌株高1.3倍。因此，该诱导强化基因编辑系统实现在基因编辑阶段诱导同源重组相关基因表达，提高基因编辑准确度，而在细胞生产阶段不加诱导剂使得同源重组相关基因表达降到正常水平，不干扰细胞的正常生长和产物合成（图3）。为强化其它非常规酵母的基因编辑效率提供理论基础和技术支持，同时也为毕赤酵母高效利用甲醇合成高附加值产物的工业生产提供优势底盘菌株。

图3：Tet-On诱导型启动子强化同源重组基因编辑效率及应用。（A）诱导剂aTc在CRISPR-Cas9基因编辑操作过程中的添加阶段；（B）GUT1基因在aTc不同添加阶段的敲除效率；（C）Tet-On启动子对多片段重组效率的调控；（D）诱导强化同源重组菌株在20g/L甲醇培养基中的生长；（E）诱导强化同源重组菌株的甲醇消耗量；（F）诱导强化同源重组菌株在20g/L甲醇培养基中的脂肪醇产量。

作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请周雍进研究员代表研究团队进行了专访，为大家做进一步的深入解读。

CellPress：

请简要概述这项工作的亮点。

周雍进研究员：

这项研究主要是在巴斯德毕赤酵母中建立了基因诱导表达系统，用于强化同源重组过程，提高基因组编辑准确度。该系统的特点是在基因编辑阶段通过诱导同源重组相关基因的表达，实现基因编辑准确度的提高，而在细胞生产阶段不加诱导剂使得同源重组相关基因表达降到正常水平，不干扰细胞的正常生长和产物合成。本研究可以为其它非常规酵母的基因编辑效率强化提供全新的调控策略，同时也为巴斯德毕赤酵母高效利用甲醇合成高附加值产物的工业生产提供优势底盘菌株。

CellPress：

研究过程中遇到了哪些困难？团队是如何克服并顺利解决的？

周雍进研究员：

Tet-On诱导系统拥有严格的调控机制，在E.coli和哺乳动物细胞中广泛应用，但是在真核酵母中应用不多，因此，如何在真核酵母中引入该Tet-On诱导系统，且对诱导剂响应的灵敏度、调控范围和阈值都是我们需要解决的关键问题。

因此，我们前期对巴斯德毕赤酵母内源组成型启动子做了大量的改造和筛选工作，最终成功获得了一系列不同诱导激活强度的启动子用于后续调控同源重组关键基因的表达。

CellPress：

团队下一步的研究计划是怎样的？

周雍进研究员：

我们目前虽然获得了这样一种诱导强化同源重组基因编辑的策略，但对于底盘菌株未来应用于复杂途径的改造或复杂天然产物的合成能力仍需进一步评估和优化。希望我们的诱导强化同源重组工程菌株不仅是对基因编辑效率的提升，在面对胁迫环境和有毒产物的合成时仍能保持细胞鲁棒性，并用于工业化生产。

CellPress：

最后，是否可以与我们分享一下选择Trends in Biotechnology来发表这个工作的原因？

周雍进研究员：

Cell Press细胞出版社旗下Trends in Biotechnology一直是极具影响力的综述期刊，其针对的合成生物学、基因组编辑和代谢工程等科学领域一直提供专业的综述指导，我们已经发表多篇综述或者评述论文，体验非常好。

当得知它在去年开始发表研究性论文时，我们很期待，也很荣幸我们的工作可以被Trends in Biotechnology认可。

主编Matthew Pavlovich博士和编辑Alex Munro-Clark博士为我们的稿件提出了很多专业的建议，使我们的工作最终更完善地呈现和发表。

作者介绍

白帆

博士

白帆，博士，中国科学院大连化学物理研究所合成微生物学研究组助理研究员。吉林农业大学获得环境科学学士学位（2010）；中国科学院大学获得环境工程硕士学位（2013）；德国卡尔斯鲁厄理工大学获得细胞生物学博士学位（2017）；2018-2021年在北京大学从事博士后研究；2021-2024年在中国科学院大连化学物理研究所从事博士后工作。主要从事毕赤酵母甲醇生物转化和合成生物学工具开发的研究。先后在New Phytologist、Algal Research和Synthetic and Systems Biotechnology等期刊发表SCI论文8篇。

周雍进

研究员

周雍进，博士，长聘研究员，博士生导师，中国科学院大连化学物理研究所合成微生物学研究组组长，张大煜优秀学者，国家自然科学基金委杰出青年基金项目获得者（2024）、国家自然科学基金委优秀青年基金项目获得者（2019）、国家引进人才青年项目入选者（2018）。曾在Cell, Nature Energy, Nature Metabolism, Nature Chemical Biology, Nature Communications, JACS, PNAS等期刊发表论文100余篇，被引用7400余次。曾获得中国药学会科学技术奖一等奖，国际代谢科学会议青年科学家奖“伦世仪”基金会杰出青年学者奖，全国生物技术创新大会“最具发展潜力奖”以及安捷伦“ACT-UR”研究科学奖。目前担任Biotechnology Journal主编，Synthetic and Systems Biotechnology及BioDesign Research副主编，FEMS Yeast Research等多个学术期刊编委。