原子尺度上的追逐｜专访李雪明：只能自己用的工具不是工具

【编者按】

大至蓝鲸，小至病毒，生物的世界，可谓千差万别。但无论形态多么丰富，生命的奥秘却藏在蛋白质之中——它们好比构筑生命大厦的砖石，决定着生命可能具有的生物功能。要探究蛋白质结构，这就进入了微观的世界，是对纳米级别世界的窥探。1纳米相当于把一根头发丝切成5万份。要看清蛋白质结构，必须有“火眼金睛”。

中国在蛋白质领域曾有杰出建树。上世纪70年代初期，中科院物理所、中科院生物物理所、上海生化所、北京大学化学系、北京大学生物系共同组成的“北京胰岛素结构研究组”测定了亚洲第一个蛋白质晶体结构——猪胰岛素三方二锌晶体结构，这是中国结构生物学历史发展的起点。

历经跌宕起伏，50年过去后，中国的结构生物学家再次站上国际科研队伍的前列，试图在近原子分辨率下探索生命的奥秘。在最近向世界级高水平之巅发起的攀登中，清华大学结构生物学高精尖创新中心（下称“高精尖中心”）无疑是最耀眼的一支队伍。

该中心于2015年在北京市高等学校高精尖创新中心建设计划下应运而生，但该中心的力量积累则需要再往前推进20年。现年75岁的中国科学院院士、中国冷冻电镜先行者隋森芳即是早期最重要的力量之一，至今依然在该中心从事科学研究，并培育出不少当下的中坚力量。

近日，澎湃新闻（www.thepaper.cn）记者来到清华大学，专访了清华大学生命科学学院院长、结构生物学高精尖创新中心执行主任王宏伟教授，清华大学医学院教授、结构生物学高精尖创新中心副主任李海涛，清华大学生命科学研究员、结构生物学高精尖创新中心PI李雪明，清华大学生命科学研究员张强锋，去年刚从清华大学生命科学学院博士毕业、新晋“世界最具潜力女科学家奖获得者”白蕊。通过这五位和高精尖中心深度交集的科学家向读者展现出：伴随着该中心的发展壮大，近几年来中国结构生物学如何再次站上世界前列。

“如此纷繁复杂的物质世界最终却归于一百多种原子的排列组合，这其中蕴藏的奥秘，是如此的神奇，令满怀好奇的人们虽献身终生却难窥其一斑。”清华大学生命科学研究员、结构生物学高精尖创新中心PI李雪明在获得“2015年度求是杰出青年学者奖”之时曾如此写下他所从事的研究工作。

彼时，李雪明从美国加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）回到清华大学才近一年时间。回国之前，李雪明是加利福尼亚大学旧金山分校程亦凡实验室的博士后，他直接参与的“直接探测相机”的开发最终掀起了随后冷冻电镜（cryo-EM）在生物学领域的“分辨率革命”。

1979年出生的李雪明在2002年和2005年分别于北京科技大学获材料物理专业学士和硕士学位，2009年于中国科学院物理研究所获凝聚态物理专业博士学位。其和程亦凡都是物理出身，均师从中国科学院院士、著名物理学家、电子显微学家、中国科学院物理研究所研究员李方华，只不过他们的博士生涯前后间隔18年。

近日，李雪明在接受澎湃新闻记者（www.thepaper.cn）专访时提起当年的“转行”契机，源于其已经转行研究冷冻电镜的同门师兄程亦凡想找一位做计算的人，“我导师推荐我考虑一下，那个时候我整天在写程序，正好匹配上了。”

从物理跨入生物领域，对李雪明来说，“其实是样品变了，本质的东西没有变。”而吸引点在于，其博士之前的工作是用电子衍射晶体学和图像处理技术结合将功能材料的分辨率提高到1埃以上，也就是0.1纳米，这是生物学领域望尘莫及的。“当时冷冻电镜下的生物分子结构的分辨率基本在7-8埃，将近1纳米，里面有很多提高的空间，我可以去做很多事情。”

站在“分辨率革命”起点

2017年度的诺贝尔化学奖授予了英国剑桥大学科学家理查德·亨德森（Richard Henderson）、美国哥伦比亚大学科学家约阿基姆·弗兰克（Joachim Frank）、瑞士洛桑大学科学家雅克·迪波什（Jacques Dubochet），以表彰他们发展了冷冻电子显微学技术，以很高的分辨率测定溶液里的生物大分子的结构。

上述三位科学家均是在上世纪八十年代前后解决了冷冻电镜观察生物样品的技术难题，然而在此后近30年时间里这种方法仍然不被结构生物学家们青睐。当时尚存在的最大问题是一直达不到足以和X射线晶体学技术媲美的分辨率。在更多突破性技术出现之前，只有高对称性的大病毒才能通过冷冻电镜获得近原子分辨率结构。

李雪明在2017年诺贝尔化学奖花落冷冻电镜之后曾专门撰文《冷冻电镜：在原子尺度上观察生命》。他在形容十几年前用冷冻电镜观察只有几百千道尔顿(kDa)分子量的大分子复合物时如此写道：当噪音强度固定的时候，越小的物体，信噪比就会越低。类比于我们在黑夜里很容易就能看清楚一座大楼，但很难看清楚一只小蚂蚁。

这一局面最终于2013年左右被彻底打破。简单来说，冷冻电镜方法就是把蛋白质样品迅速冷冻在玻璃化水里，用电子显微镜给蛋白质拍摄多个不同取向的单颗粒蛋白的二维图像，随后用计算机图像处理算法将这些二维图像重构成完整的三维图像。从上世纪九十年代开始，科学家们试图从相机入手来解决分辨率低的问题。

其中一支长期的攻克队伍来自于加州大学旧金山分校的David Agard和程亦凡的团队，他们与Gatan公司合作，基于直接电子探测器技术，发展和实现了电子计数技术。李雪明在这款相机接近应用时加入了该项目，在博士后工作期间，他为分辨率的进一步提升写下了浓墨重彩的一笔。

2013年5月，李雪明以第一作者身份在《自然-方法学》（Nature methods）上发表了关于电子计数相机和电子显微像漂移纠正的突破性工作，并验证可以让仅具有D7对称性、约700kDa的蛋白质实现近原子分辨率的三维重构。

程亦凡曾如此评价李雪明，“他是一名非常聪明的科学家，图像漂移校正技术的一个核心方面实际上就是他的一个想法，所以我们用相机的时候这也是水到渠成的一个做法。”2013年底，程亦凡等人用最新的技术在顶级学术期刊《自然》（Nature）证明，冷冻电镜可以将膜蛋白TRPV1蛋白的结构解析到3.3-3.4埃的水平。

这一结果在一定程度上宣告了大多数结构生物学家必须重新选择手中的“利器”，冷冻电镜一举逆袭成为结构生物学领域最抢手的工具。

彼时的清华虽配置了冷冻电镜，但同样面临着分辨率迟迟无法提高的困境，李雪明在2014年的满载而归无疑是备受欢迎的。“一回来正好赶上K2电子计数相机的安装，把相机和相应软件配置起来，然后教大家如何使用，解释原理是什么，同时也培训了一些人，回到国内的工作很快就做起来了。”李雪明表示。

冷冻电镜自动化系统：“今年搭出一个能跑的框架”

2013年至今，各大实验室普遍使用的单颗粒分析技术日臻完善。李雪明近年来对于该技术的追求在于：建立一套先进的冷冻电镜自动化控制和数据分析系统去大幅度提升效率和可靠性。

现行方法需要研究人员获得成千上万张高质量冷冻电镜照片，随后进行庞大的数据计算处理，仅清华的冷冻电镜平台，每天产生的数据量达到10-20 TB级（1TB=1024GB，1GB=1024MB）。整个流程涉及大量的非自动化工作，这需要大量的人力投入，且耗时数月，同时结构解析最终的质量还需高度依赖使用者的个人经验。

这对技术被商业化大规模利用显然是不利的。冷冻电镜的商业化时代目前尚处于起步阶段，领域内的先行者们认为，冷冻电镜将是药物研发的一个重要平台，甚至可能会改变新药研发的模式。

清华大学的团队在该领域也已抢先布局。2017年，水木未来（北京）科技有限公司（下称“水木未来”）在北京成立，这家专注于临床前新药研发加速服务的平台型公司由清华大学生命科学学院院长、结构生物学高精尖创新中心执行主任王宏伟团队基于结构生物学和高性能计算相关技术孵化而来，李雪明也在该公司担任科学顾问。

李雪明团队的目标是，把样品制备之后的所有步骤整合到一个“黑盒子”里去，靠自动化分析系统去完成数据采集和图像处理。“我们现在做还没有完全完成，但瓶颈越来越少了，今年大概能把技术整合起来搭出一个能跑的框架出来，能够真正运行起来。”

除对成熟技术自动化改进外，李雪明的另一焦点在于如何帮助生物学家们看到更真实的微观世界。在采访过程中，他着重提及冷冻电子断层扫描术（Cryo-ET），目前的思路下，这一方法是通过对低温冷冻细胞进行聚焦离子束（FIB）减薄，对减薄的细胞样本（冷冻薄片）拍摄一系列二维图像，然后将其重建为 三维结构。

这一方法可以帮助科学家们在原始环境下直接观察到细胞的清晰结构。“我觉得这是非常有意义的，如果将来能真正实现，做到像单颗粒分析或者晶体学这些办法一样成熟，那么我觉得做生物的人的逻辑就完全不一样了。这是一个很重要的方向，很多国际团队几乎都在朝着这方向研究。”李雪明表示。

如何在液氮冷冻状态下找到样品中的感兴趣区域并精准地切到足够薄的状态？这是目前需要解决的最关键问题之一。李雪明解释道，“以小鼠肝为例，它的尺寸是几毫米，细胞尺寸一般在十几到几十微米，我们第一刀切出来大概能到100微米厚，然后把它冻起来，但液氮温度下再怎么往下切就比较难，而我们最终的目标是要切到200纳米厚，还要正好切在要研究的区域上。”

展望这项前沿技术，李雪明表示，“单颗粒技术从真正能被用以解析生物样品结构到2013年的成熟应用，大概走了35年时间，Cryo-ET这些年一直在推进，聚焦离子束切割等新技术在逐渐出现，但没有获得实质性的进展，还需要要积累一段时间。”但他相信，技术永远是越走越快，“我觉得再过5年左右能进一大步，至少这一点是没有问题的。”

“我有样品恐惧症，技术是个苦活”

细看李雪明回国之后的论文成果，这位学物理出身的科学家，和生物领域靠得越来越近。

在方法学研究的同时，李雪明近年来还开展了细菌分泌系统的生物学研究，利用冷冻电镜技术解析了多个细菌分泌系统的结构，并研究相关分泌机制，提出了一项抑制细菌生物膜分泌的新思路。

提及这些，李雪明表示，“其实从博士期间开始，我最担心的一件事就是没样品，做技术的人可能都会有‘样品恐惧症’，虽然方法研究好像跟样品没有关系，但实际上强烈依赖样品，比如我要处理图像，那我必须先有样品才能获得图像。而且要‘理解’样品，理解其中的问题。样品提供者对你技术工作的理解与信任，尤其是长期的合作与帮助，至关重要。”

此外，冷冻电镜技术服务于生物学，“明白生物问题是什么？我在结构处理的时候才能够有针对性。”李雪明认为，其团队的生物学研究能促进团队的冷冻电镜技术和方法学研究，使研究更加切合实际需求，定位于解决实际问题。

稳定的样品来源非常重要，稳定的人才队伍对李雪明来说或许更为关键。“有人说有人才更迭会越来越好，但人员流动对做技术来说却非常不利。尤其对做交叉学科技术的尤其不利，因为培养一个单一技术背景的人理解多学科的内容是一个长期工作。它需要一个人持续地做下去，哪怕一项小的技术。但现在的体制和机制，以及氛围，很难保障技术人员在实验室里稳定工作下去。”

他笑称自己就像“光杆司令”，其余全是“流动人员”，而他很多想法也停留在由不同的人“从零起步、再回到零重新起步”的无奈状态。如果把技术比作是一幢不断垒高的建筑，那么每次人员的大流动都是一次摧毁。

尽管高精尖中心多年来一直给予支持，但李雪明希望能有更多的渠道给技术人员更好的成长和工作环境。在他眼里，技术人员在科学进步中是举足轻重的，这一群体让科学家们的很多想法得以真正实现。“吸引更多的不同领域技术人员，尤其是高科技公司中的高级技术人员，愿意加入到科研相关的技术开发中来，作为一个可以安身立命，并奋斗终身的职业，非常重要。”

此外，李雪明认为现行的以论文为基本考核指标的学生考核机制对技术研究也尤为不合适。“发论文其实是中间过程，有成果就发，没有就先不发，它是一个副产品。我们真正的目标是做谁都可以用的通用技术和工具，发了文章却不好用或者别人用不起来的工具不能称为工具。”初衷即为发论文的工作往往就是昙花一现。