全球病毒猎手“拆解”新冠病毒，反驳阴谋论：RNA不会撒谎

新冠肺炎疫情发生以来，“实验室病毒泄漏”、“人工合成新病毒”等流言在网络上持续传播，其中大部分围绕中科院武汉病毒所。该所石正丽研究员率领的团队是蝙蝠病毒研究领域的权威，是中国SARS（严重急性呼吸道综合征）病毒的源头攻克团队，在此次新冠病毒科研攻关中也已率先揭示新冠病毒与来源于中国菊头蝠样本的一株冠状病毒（RaTG13 ）序列一致性达96%。

近日，由6位科学家组成的一支国际团队联合在virological.org网站上发表一篇新冠病毒起源相关的文章 “The Proximal Origin of SARS-CoV-2”。 virological.org网站是一个分析和解释病毒分子进化和流行病学的论坛，因此该文章尚未正式发表，但该文章被业内称为最专业的反驳，堪称“最强技术性分析”。

他们就新冠病毒基因组中的两个疑似人为干预的特征进行了功能性和结构性的比较分析，这些分析提供了大量的证据推论出：新冠病毒不会是实验室工程制造而泄漏的病毒，而应该是病毒自然进化的产物。

这6位科学家分别为著名病毒进化学家美国斯克里普研究院免疫学和微生物学系Kristian G. Andersen副教授（一作及通讯作者）、英国爱丁堡大学进化生物学研究所Andrew Rambaut、美国哥伦比亚大学梅尔曼公共卫生学院感染与免疫中心主任W. Ian Lipkin、澳大利亚悉尼大学玛丽·巴希尔传染病和生物安全研究所教授Edward C. Holmes、美国杜兰大学医学院微生物与免疫学教授Robert F. Garry。

值得注意的是，作者当中来自哥伦比亚大学的Lipkin在国际流行病学领域声明显赫，被世界知名科普杂志《Discover》誉为“世界上最知名的病毒猎手”。 过去几十年来，Lipkin一直置身于世界疫情爆发的最前线，包括纽约西尼罗病毒（1999年）、中国SARS（2003年）、MERS（2012-2016 年）、美国寨卡（2016年）和印度脑炎（2017年）。2003年，Lipkin是首批应邀协助中国抗击SARS的国际知名专家。此后，他还协助建立了上海巴斯德研究所、广州生物医药研究所等研究机构。

就在此次疫情暴发后的1月28日至2月4日，Lipkin再次来到中国，针对新冠病毒推进与中方的合作计划实施。1月30日凌晨6时，钟南山院士在广州会见了Lipkin，就新型冠状病毒感染的肺炎疫情进行探讨，Lipkin当时说，有很多国际顶级科研团队期望参与到此次疫情防控中，和中国一起共渡难关。

根据哥伦比亚大学梅尔曼公共卫生学院感染与免疫中心在该网站同时提供的一份总结，作者们提到，第一个疑似人工干预的特征是，基于结构模型模拟和早期生化实验，新冠病毒在受体结合区域（RBD）的氨基酸突变使得其相对于SARS-CoV而言与人血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合亲和力更高。

所谓的ACE2受体，即是人与冠状病毒结合的关键部分，也就是说，与人ACE2受体结合的亲和力越高，则病毒的传播性越强。而正是因为新冠病毒基因组序列上与受体结合的某些关键氨基酸突变与之前的科研文章中预测可用于增强亲和力的氨基酸突变一致，有传言即称这是由实验室定向突变而生成的人造病毒。

作者们在文章中分析，如果使用SARS-CoV的基因组为参考，之前的实验证明：新冠病毒中影响与人ACE2受体结合亲和力的6个相应氨基酸为L455，F486，Q493，S494，N501和Y505(注:F486代表在第486位的氨基酸是苯丙氨酸)。

在此前的研究中，实验证明如果SARS-CoV由亮氨酸突变为苯丙氨酸(即新冠病毒的F486)，则会显著提高病毒与人体受体结合的亲和力。然而，该突变在自然宿主蝙蝠和穿山甲的相关冠状病毒中都早已经存在了，也就不能说这是刻意人为生成的突变。

作者们还提到，不仅是F486，新冠病毒中其他5个关键氨基酸也与穿山甲的氨基酸序列完全一致。此外，F486并不是之前预测的改造病毒亲和力最强的突变方法，另外5个氨基酸也都有可能导致亲和力的增强。

总结中提到，如果真是某个分子生物学家的邪恶成果，那他完全有可能将应用已有的技术把其他5个氨基酸也都突变成为最可怕的一个的组合。所以看起来氨基酸F486的出现更像是新冠病毒针对人类和其他动物宿主发生的一个自然的进化突变。

第二个被质疑人工干预的关键特征是，新冠病毒在关键的刺突蛋白（S蛋白）上有1个可疑的酶切位点并在旁边发现了在其他冠状病毒中不存在的连续的12个核苷酸的序列。

值得注意的是，酶切位点通常是人工基因重组技术留下痕迹，因此也有传言据此称这是实验室改造的病毒。

尽管尚不完全清楚，但这个可疑酶切位点和连续的12个核苷酸的序列会使得新冠病毒在S蛋白上形成一个O-linked 的聚糖结构。而此前的研究则表明，类似的结构可以导致禽流感病毒和新城疫病毒提高致病性。

文章指出，新冠病毒与任何已知的冠状病毒在核酸序列组成上有不少细节上的变化，说明这个病毒并不是由一个已知的模板改造而生成的病毒。再退一步，即使的确存在一个不为科学界所知的病毒模板，且通过长期细胞培养的方式逐步得到提高受体结合亲和力的氨基酸突变的病毒，然而这个O-linked的聚糖结构是不可能能通过体外细胞培养的方式获得，因为这种突变通常需要机体免疫系统的参与才能产生。

在同一网站的另一篇由Bill Gallaher 教授发布的文章中也同样提到这一段特异的12个核苷酸的序列的突变插入。Gallaher认为，这不像是一个分子生物学家的常规操作行为，如果他真想做这个可怕的实验，他或许可以做的更好。

Gallaher甚至还分析认为，亲缘关系最近的蝙蝠冠状病毒RaTG13实际上“一点都不近”。他最后写道，“RNA不会撒谎”。

值得注意的就是，针对外界层出不穷的阴谋论，当地时间2月18日，国际顶级医学期刊《柳叶刀》（The Lancet）在线发表了一篇通讯文章，来自8个国家的27名知名公共卫生科学家签署声明：支持中国抗击 2019新型冠状病毒疾病(COVID-19)疫情中的科研、公共卫生、医务工作者。

该声明直指疫情期间出现的各种阴谋论。这27位科学家提到，在这次疫情中相关数据迅速、公开且透明的共享如今正受到关于该疾病起源的谣言和错误信息的威胁。“我们在此共同强烈谴责认为该新型冠状病毒疾病 COVID-19并非自然起源的阴谋论。”

这份声明认为，来自世界各国的科研工作者已经对引发该疾病的病原SARS-CoV-2的全基因组进行了分析并公开发表了结果，这些结果压倒性地证明了该冠状病毒和其它很多新发病原一样来源于野生动物。科学家们强调，阴谋论除了制造恐慌、谣言、偏见、损害全球共同抗击该疾病的工作外，别无它用。“我们支持世界卫生组织总干事的呼吁：促进科学的论证和团结，而非误传和猜想。”

这27位科学家包括：英国皇家学会的Jeremy Farra爵士，美国疾控中心（CDC）传染病中心（NCID）前主任James M Hughes，美国国家科学基金会前主任Rita Colwel，尼帕病毒的发现者之一、马来西亚医学科学院Sai Kit Lam教授，世卫组织全球疫情警报和反应网络（GOARN）指导委员会成员John S Mackenzie，以及多名美国国家医学科学院成员、传染病研究和公共卫生领域的权威科学家。

而在2月19日晚间，武汉病毒研究所在其官网也发布“致全所职工和研究生的一封信”，该信的署名为“中国科学院武汉病毒研究所领导班子全体成员”。该公开信称：网络流传涉及我所若干谣言，如“新冠病毒源于人工合成”“病毒是从P4泄露的”“军方接管P4”“某研究人员因病毒泄露死亡”“某研究生是‘零号病人’”“某研究员实名举报所领导”等，引发了各界的持续关注，对坚守科研一线的我所科研人员造成极大的伤害，也严重干扰了我所承担的战“疫”应急科研攻关任务。

该公开信表示：回首过去一个多月的艰辛付出，我们问心无愧！

附论文全文翻译（有部分删减）：

自中国湖北省武汉市首次报道新型肺炎（COVID-19）以来，关于致病性病毒的起源一直存在大量讨论和不确定性。新冠病毒感染现在在中国每个省份均有病例。截至2020年2月14日，确诊病例为64473例，其中1384例死亡。由于对轻度和无症状病例的报告有限，且该病毒显然能够有效地人际传播，最终的病例数字可能被低估了。基于该病毒有向卫生保健系统较薄弱的国家传播的可能性，世界卫生组织（WHO）已宣布新冠肺炎为国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)。目前还没有针对这种疾病的疫苗或特效治疗方法。

新冠病毒是已知的第7种可感染人类的冠状病毒。除新冠病毒外，SARS-CoV、MERS-CoV也可导致严重疾病，其余4个冠状病毒HKU1、NL63、OC43和229E与轻度呼吸道症状相关。

在这篇论文中，作者们回顾了可以从现有基因组序列数据的比较分析中推断出的新冠病毒的起源和早期进化。特别地，作者们提供了一个关于新冠病毒基因组显著特征的新观点，并讨论了这些特征可能出现的场景。重要的是，这项分析提供了证据，证明新冠病毒并非源自实验室，也不是一种故意制造的病毒。

通过对α和β冠状病毒（冠状病毒科家族）的基因组比较，确定了新冠病毒基因组的两个显着特征：第一，基于结构模型模拟和早期生化实验，新冠病毒似乎发生了进化，更易与人类的ACE2受体相结合;第二，新冠病毒在关键的刺突蛋白（S蛋白）上有一个可疑的酶切位点，并在旁边发现了在其他冠状病毒中 不存在的连续的12个核苷酸的序列，这个可疑酶切位点和连续的12个核苷酸的序列使得新冠病毒在S蛋白上形成3个O-linked 的聚糖结构。

（a）新冠病毒S蛋白氨基酸突变。新冠蛋白S蛋白与最接近的SARS样冠状病毒和SARS-CoV-1的S蛋白一致。新冠病毒和SARS-CoV Urbani毒株中，与ACE2受体接触的S蛋白中的关键氨基酸都用蓝色方框标记。（b）多碱基酶切位点和O-linked聚糖结构的获得。多碱基酶切位点用灰色标记，O-linked聚糖结构用蓝色标记。多碱基酶切位点和O-linked新冠病毒所特有的，以前从未在乙型冠状病毒中发现。注：使用的基因序列来自NCBI GenBank，登录号MN908947、MN996532、AY278741、KY417146、MK211376。穿山甲冠状病毒序列来自SRR10168377和SRR10168378 (NCBI BioProject PRJNA573298)。

新冠病毒受体结合区域的突变

新冠病毒、SARS相关冠状病毒S蛋白与ACE2受体结合的关键部分称作受体结合域（RBD），该区域高度可变。如果使用SARS-CoV的基因组为参考，之前的实验证明新冠病毒中影响与人ACE2受体结合亲和力的6个相应氨基酸为L455，F486，Q493，S494，N501和Y505（注:F486代表在第486位的氨基酸是苯丙氨酸） 。RBD中的6个氨基酸决定了冠状病毒感染宿主的物种范围。与具有96%基因序列相似度的中华菊头蝠SARS-CoV相比，新冠病毒的上述6个氨基酸有5个发生了突变。基于结构模型模拟和早期生化实验，新冠病毒的RBD与人类、非人灵长类、雪貂、猪、猫等的ACE2受体具有高亲和性。相比之下，新冠病毒和其他一些物种的SARS样病毒的亲和力小很多，包括啮齿动物、果子狸等。

新冠病毒S蛋白中的F486（苯丙氨酸）与SARS-CoV Urbani毒株中的L472（亮氨酸）相对应。值得注意的是，在SARS-CoV细胞培养实验中，亮氨酸L472突变为苯丙氨酸(L472F)，这一突变被认为会显著提高SARS-CoV RBD与人类ACE2受体结合的亲和力。然而，这一突变在自然宿主蝙蝠和穿山甲的相关冠状病毒都早已经存在 (图1a)。虽然新冠病毒与人类ACE2受体的亲和力高，但其RBD还不是最完美的结合构象，F486并不是之前预测的改造病毒亲和力最强的突变方法，新冠病毒 RBD中的另外5个关键氨基酸也都有可能导致亲和力的增强。此前的研究对ACE2受体蛋白进行结构生物学分析，并预测了与其匹配程度最高的配体氨基酸序列，这与在新冠病毒RBD中发现的并不同。氨基酸F486的出现更像是新冠病毒针对人类和其他动物宿主发生的一个自然的进化突变，并非基因工程产物。

多碱基酶切位点和O-linked聚糖结构

新冠病毒的第二个显著特征是，刺突蛋白S1和S2亚基交界处有一个多碱基酶切位点（RRAR）。该位点除了有2个精氨酸和1个丙氨酸，还有一个脯氨酸也插入其中，因此，完全插入的序列是PRRA(图1b)。由脯氨酸插入所产生的强转变预计会导致在多碱基酶切位点侧面的S673、T678和S686上增加O-linked聚糖结构。多碱基酶切位点此前从未在乙型冠状病毒中观察到过，这是新冠病毒的一个独特特征。新冠病毒多碱基酶切位点的功能目前尚不清楚。但通过对SARS-CoV的实验发现，在S1/S2交界处设计多碱基酶切位点可以增强细胞间融合，但不影响病毒的进入。禽流感病毒的血凝素蛋白(HA)的两个亚基的交界处也能产生多碱基酶切位点，条件是病毒处于高速复制和传播中（例如在高密度鸡群），多碱基酶切位点能被弗林蛋白酶和其他蛋白酶快速识别并切割。而HA与冠状病毒S蛋白在细胞-细胞融合和病毒进入过程中起着类似的作用。通过插入或重组获得HA中的多碱性酶切位点，可将低致病性禽流感病毒转化为高致病性病毒。流感病毒HA在细胞培养或通过动物反复传代后，也可观察到多碱基酶切位点的产生。类似的，新城疫病毒的一株无毒分离株，在鸡的连续传播过程中通过在其融合蛋白亚基的连接处逐步获得多碱基酶切位点，会变得具有高致病性。另外，3个O-linked聚糖结构的潜在功能尚不清楚，但它们可以产生一个“粘蛋白样结构域”，以保护新冠病单S蛋白上的某些潜在表位或关键氨基酸。作者们提到，需要进行生化分析或结构研究来确定O-linked聚糖结构位点是否被利用。

新冠病毒的起源

新冠病毒不太可能是通过对现有SARS相关冠状病毒的实验室操作而出现。如上所述，其RBD还不是最完美的结合构象，F486并不是之前预测的改造病毒亲和力最强的突变方法。此外，如果已经进行了基因操作，我们应该看到对β冠状病毒使用了反向遗传学系统，但情况并非如此，因为遗传数据显示，新冠病毒并非源自任何以前使用过的病毒骨架。

因此，我们提出了两种可能解释新冠病毒起源的方案:第一，人畜共患病转移前非人类动物宿主中的自然选择;第二，人畜共患病转移在人类中的自然选择。我们还讨论了在培养过程中的选择是否会产生相同的观察到的特征。

在动物宿主中进行自然选择

鉴于新冠肺炎暴发早期的很多病例有武汉华南海鲜市场接触史，那么该市场可能存在动物来源。又考虑新冠病毒与蝙蝠SARS样冠状病毒（尤其是RaTG13）序列相似度极高，那么蝙蝠来源这一点也是可靠的。但需注意的是，新冠病毒从蝙蝠到人类之前，很可能已在多个物种的中间宿主中流传。而此前SARS-CoV的中间宿主是果子狸，MERS-CoV的中间宿主是骆驼。通过类比，与新冠病毒密切相关的病毒可能在一个或多个动物物种中传播。初步分析表明，非法进口到广东省的马来穿山甲中就含有一种与新冠病毒相似的冠状病毒。虽然RaTG13在全基因组上最接近于新冠病毒,但马来穿山甲和新冠病毒在RBD的6个关键氨基酸一致 (图1)。然而,目前尚未从整个基因组层面上确定穿山甲和新冠病毒的相似性。此外，穿山甲冠状病毒不含多碱基酶切位点。这种突变需要病毒在较高种群密度、并且ACE2基因类似于人类同源蛋白的生物集群中大量复制才有可能产生。进一步鉴定穿山甲冠状病毒的特征，以及对其他可疑动物的冠状病毒筛查，将是未来溯源的重点。

在人体内隐秘适应

新冠病毒的祖先也有可能从非人类动物跃迁到人类身上，上述的基因组特征是通过在随后的人与人之间的传播中进行适应而获得的。我们推测，一旦病毒获得了这些适应（同时或连续），就将带来疫情的暴发，进而产生足够大且异常的肺炎病例群，医疗监控系统被触发，并发现了病毒。

到目前为止，所有进行测序过的新冠病毒基因组都具有很好的适应性RBD和多碱基酶切位点，因此它们是从一个共同祖先那里获得的这些特征。穿山甲中存在一种与新冠病毒非常相似的RBD，这意味着这些特征（高适应性RBD等）可能在传播到人类中以前已经存在于病毒中，尽管我们还没有确定非人类病毒源头。 这使得多碱基酶切位点插入发生在病毒人际传播过程中，和甲型流感病毒HA一样，需要一种特定的插入或重组事件，才能使新冠病毒的突然出现成为流行病病原体。使用现有的基因组序列数据估算新冠病毒的最新共同祖先（tMRCA）的时间，表明病毒在2019年11月下旬至12月上旬出现，这与最早的回顾性确诊病例研究的时间相符。因此，这种情况下，我们可以假定，在最初的病毒由动物转移到人身上与人际传播时多碱基酶切位点的获取之间，存在一段无法识别的病毒人际传播时期。如果在很长一段时间内，首先发生的很多人畜共患病事件（病毒由动物转移到人身上）能够产生人与人之间传播的短链，那病毒就会有足够的机会大暴发。这其实就像阿拉伯半岛上MERS-CoV传播的情况，所有人类病例都是病毒从单峰骆驼反复传播的结果，产生了单一感染或人与人之间的短链传播。迄今为止，在过去8年中感染了2499个病例之后，MERS-CoV还尚未完全适应人类宿主。

如何测试冠状病毒的隐秘传播使它在人类中产生了适应性呢？血清样品的宏基因组研究可能会提供重要信息，但鉴于病毒时间相对较短，因此可能无法在历史样品中检测到低水平的新冠病毒。回顾性血清学研究可能会提供参考，并且已经有科学家进行了一些此类研究。一项研究发现动物进口贸易商对冠状病毒的血清阳性率为13％，而另一项研究指出，中国南方一个村庄的居民中有3％对这些病毒呈血清阳性。值得一提的是，武汉的200名居民没有显示冠状病毒的血清反应活性。然而，至关重要的是，这些研究无法区分阳性血清反应是由于先前感染了SARS-CoV-1还是新冠病毒。应该进行进一步的回顾性血清学研究，以确定之前人类在不同地理区域接触过乙型冠状病毒的程度，尤其是使用可以区分多种乙型冠状病毒的测定方法。

实验室培养选择

多年来，世界各地的多个BSL-2（生物安全第二等级）实验室一直在进行涉及蝙蝠SARS样冠状病毒在细胞培养和/或动物模型中传代的基础研究。也有一些记录表明，在BSL-2密闭环境下工作的实验室人员能在实验室获得SARS-CoV-1。因此，我们必须考虑实验室有意或无意泄露了新冠病毒的可能。从理论上说，新冠病毒的RBD突变位点有可能是通过细胞培养传代过程中的适应取得的，这种情况已经在SARS-CoV和MERS-CoV的研究中被观察到。但是，如果是功能性的，则多碱基酶切位点或O-linked聚糖的存在反对了上述情况。因为只有在细胞培养物或动物中长时间传播低致病性禽流感病毒的情况下，才能产生多碱基酶切位点。此外，如果真的通过细胞培养或动物传代产生新冠病毒，则需要事先分离具有非常高遗传相似性的祖病毒，在具有人类同源ACE2的雪貂等动物中大量传代。要求同时获得多碱基位点和氧原子连接多糖的结构，可能性不大。而O-linked聚糖的产生是否会在细胞培养传代中发生也是值得怀疑的，因为这种突变通常表明免疫系统的参与，这在体外是不存在的。

结论

在全球新冠疾病的公共卫生紧急情况中，我们有理由去想为什么流行病的起因十分重要。对动物病毒如何跨越物种、如此迅速地感染了人类的详细了解将有助于预防未来的人畜共患病事件。例如，如果新冠病毒已预先适应了另一种动物，那么即使目前的流行病得到控制，我们也仍有未来再发生此类事件的风险。相反地，如果我们描述的适应过程发生在人类中，那么即使我们重复此前的人畜转移，病毒也不太可能暴发，除非发生了相同系列的突变。此外，确定与新冠病毒最接近的动物亲缘将大大有助于病毒功能的研究。RaTG13 bat序列的可用性也的确促进了本研究进行的比较基因组分析，有助于揭示RBD中的关键突变以及多碱基酶切位点的插入。

本文描述的基因组特征可以部分解释新冠病毒在人类中的传染性和传播性。目前的基因组证据不支持新冠病毒是实验室产物的观点，但目前尚无法证明或反驳本文所述的其他起源。无论新冠病毒起源如何，对人类肺炎疫情和其他动物进行持续监测显然至关重要。

原文链接：http://virological.org/t/the-proximal-origin-of-sars-cov-2/398