脑声常谈丨啮齿动物Stone T-maze测试方法

Stone T-maze (STM)是一种常用于动物行为学研究的实验装置和方法。整体呈字母“T”形，一般由一个起始臂和两个目标臂构成。起始臂与两个目标臂之间有门或通道，可通过开启或关闭来引导动物的行动路径。

实验原理：

利用动物的本能和行为特点，如对新环境的探索欲、寻找食物或躲避危险的需求等。通过设置不同的任务和条件，观察动物在迷宫中的行为表现，来评估其认知能力、空间记忆、学习能力以及决策能力等。

通常包括实验准备、动物训练和正式实验等阶段。在实验准备阶段，需清洁迷宫，准备好食物奖励或其他刺激物以及记录设备等。动物训练阶段让动物在迷宫中自由探索或按照特定规则进行训练，使其熟悉迷宫环境和任务要求。正式实验时，按照预定方案操作，改变奖励类型、训练强度或线索复杂性等条件，观察并记录动物行为。任务要求小鼠穿过水到达一个黑暗干燥的目标盒子，为了逃离这种厌恶环境，小鼠必须学会正确的13个左右转弯序列以到达目标盒子。该任务可以用来评估学习和记忆，而不会像其他任务那样因为可能影响小鼠表现的因素而导致混淆结果。

Fig1 起始箱（start box）、目标箱（goal box）和迷宫（maze）的具体构造

在STM中，动物需要学习一系列正确的左转和右转顺序，以便从起始箱成功导航至目标箱。为了促进任务的学习，曾采用过食物剥夺后的食物奖励、水剥夺后的水奖励，以及通过躲避和/或逃避电击来强化。负强化通过让小鼠涉水（而非游泳）到达一个既黑暗又干燥的目标箱实现，从而提供了一种逃离水面的方式。

装置:

直线跑道和迷宫由透明或黑色亚克力制成，两者都被放入一个装有水的钢制托盘中，水位达到覆盖墙壁一半的高度（大约2.22厘米深），并且水温保持在20-24摄氏度之间。直线跑道和迷宫的墙壁使用不透明黑色亚克力建造，高度为3.81厘米，并在底部不同位置安装了0.64厘米高的脚以允许水流在墙下循环。为了防止小鼠跳出水面，直线跑道和迷宫的顶部覆盖着透明亚克力板。这些尺寸创造了一个情境，使得小鼠能够保持与地面接触的同时头部位于水面之上，但不能直立起来。直线跑道包括一条长68.58厘米、宽5.08厘米的小巷。每项试验开始时，小鼠被放置在一个完全由不透明亚克力制成的起始盒子里，盒子有一个可移除的顶部和一扇手动升起的滑动门。在起始盒子的后墙上有一块可以通过一根延伸到后墙外的杆子移动的滑动面板，如果需要的话可以用来推动小鼠离开起始盒子。起始盒子长度为11.43厘米，其高度和宽度与直线跑道和迷宫中的小巷相匹配。迷宫各处放置了五个滑动闸门。一旦小鼠成功穿越了一段迷宫，闸门就会降下，以防止小鼠在犯错后可能回退太远而导致试验失败的可能性增加。这些闸门位于连接到迷宫天花板的支撑框架内，并且实验者使用末端系有重物的钓鱼线手动开关它们。为了避免小鼠将闸门作为导航线索，在通往死胡同T形交叉点上方的小巷上设置了假闸门。封闭的目标盒子由不透明黑色亚克力制成，尺寸为宽20.32厘米×长20.32厘米，高11.76厘米。其中一面墙上设有一个开口门，其高度和尺寸与迷宫和直线跑道中的小巷相同。门口设有一个坡道，通向高于水盘底部4.78厘米的盒子内的抬升地板。这允许小鼠到达目标盒子时能逃出水面。目标盒子的顶部是可拆卸的，以便接近小鼠。

优势：

此任务的设计克服了一些在使用传统任务评估小鼠学习和记忆时遇到的问题，比如不同动机驱动的影响。通过利用小鼠逃脱厌恶环境的自然倾向，即从水中到达安全、干燥的地方，这个任务提供了一种新的、更为可靠的手段来研究小鼠的学习和记忆能力。在其他任务中评估学习和记忆时，包括水迷宫，常见的困难并不是小鼠无法学习，而是它们不愿意为预期的强化物工作，例如食物或水奖励。相反，小鼠往往花费大部分时间试图逃离实验装置。虽然水迷宫确实利用了逃脱作为强化手段，但当小鼠到达平台时，许多会选择留在水中，而不是注意平台上的视觉线索，他们经常花时间寻找逃离迷宫的方法，比如重新进入水中游泳或者从平台上跳到池边，这表明它们对目标情境感到不适。小鼠Stone T迷宫（STM）的关键在于操纵逃脱这一主要动机，以实现一致的表现。

另一个STM的优势是小鼠在整个过程中保持与地面接触，从而减轻了水迷宫中存在的重体力和肌肉功能需求。这对于比较不同年龄段的小鼠或野生型与基因改造小鼠之间的研究尤为重要。因为在STM中学习和记忆的主要衡量标准是错误次数，所以认知功能可以独立于运动功能进行评估。例如，在药物影响下即使表现出嗜睡副作用的小鼠也能以与对照组相同的错误次数完成迷宫，尽管它可能需要两倍的时间才能到达目标盒子。而在水迷宫中，运动功能的变化可能会被错误地解释为学习受损。有研究发现操作迷宫外的线索如移动目标盒子或将迷宫旋转180度，并不会影响任务表现。因此，这种迷宫的另一个优点是对依赖视觉线索的学习表现要求较低。STM通过巧妙地利用小鼠的逃脱动机，不仅提高了学习和记忆评估的可靠性，还降低了因运动能力和视力问题带来的干扰因素，使其成为一种有效的工具来研究小鼠的认知功能。这种方法的进步有助于更好地理解各种条件下的学习机制，并且对于老年动物的认知衰退研究也具有重要价值。

测试程序：

第一天，小鼠进行了直线跑训练。直线跑训练旨在建立向前移动能够让它们从水中逃脱进入目标盒子的关联。完成这一训练阶段的成功标准是在15秒内完成至少13次/15次试验，最多进行30次试验。未能达到此标准的小鼠将被排除进一步的行为测试。所有实验中，迷宫训练将在第二天开始。

为了全面评估这种新迷宫范式测量学习和记忆的能力，可评估几种不同的训练。学习的主要衡量指标是到达目标盒子的时间延迟和所犯错误的数量。错误由实验者在线评分，但是所有的直线跑训练和迷宫试验都使用视频跟踪系统记录下来。错误定义为小鼠头部完全进入错误路径。在获取期间，如果小鼠在6分钟内未能到达目标盒子，则试验终止并记为失败。任何三次失败的小鼠都将被排除进一步分析。

水动机小鼠STM：

首先，为了进行预训练，使用了一个68.58厘米长的直跑道。这个直跑道以及后续使用的迷宫是由透明或黑色亚克力材料制成的，并被放置在一个装有约2.22厘米深水的钢制托盘中，水位覆盖了迷宫内部墙壁高度的一半。这样的设置保证了小鼠能够保持与地面接触，同时头部可以保持在水面之上，但墙壁的高度又防止了它们站起来的行为。整个装置的温度维持在20至24摄氏度之间，为小鼠提供了一个相对舒适的环境以减少因温度引起的应激反应。迷宫的墙壁由3.81厘米高的不透明黑色亚克力板构成，底部设有不同位置的脚支撑，允许水在墙下循环流动。顶部则由透明亚克力覆盖，以防止小鼠跳出水面。直跑道宽5.08厘米，长度为68.58厘米，而起始箱则是完全由不透明亚克力制成，有一个可移除的顶部和一个手动升起的滑动门，用于开始试验时释放小鼠进入迷宫。这些设计上的考量对于研究年龄相关学习和记忆缺陷至关重要，因为它们帮助排除了非认知因素（如游泳能力、疲劳或体温调节困难）对实验结果的影响。此外，通过这种方式，研究人员能够更准确地测量小鼠的学习能力和记忆力，而不受其他变量的干扰。例如，在测试过程中发现，无论年龄大小，使用水作为激励的所有小鼠都能迅速穿过迷宫，这表明水动机版本的STM对于评估小鼠的空间学习和记忆功能是非常有效的。

在第一天，小鼠接受了直跑道训练。这种直跑道训练的目的是建立一个联系，即向前移动可以让它们从水中逃入目标盒子。成功完成这一训练阶段要求小鼠在最多30次试验中，在至少13次中的15秒或更短时间内到达目标盒子。未能达到此标准的小鼠将被排除在进一步的行为测试之外。对于所有实验，迷宫训练将在接下来的一天开始。在这个实验中，6到8只小鼠在一天内完成了全部15次迷宫获取试验。训练一周后评估记忆保持情况。

学习的主要衡量指标是到达目标盒子所需的时间（潜伏期）和犯下的错误数量。错误是由实验者在线评分的，一次错误定义为小鼠头部完全进入错误路径。如果在获取过程中，小鼠未能在6分钟内到达目标盒子，则该次试验终止并记为失败。任何连续三次失败的小鼠都将被移除出进一步分析。

电击动机小鼠STM：

对于这个版本的迷宫，直跑道预训练要求小鼠成功避免足部电击，该电击会在小鼠进入跑道后10秒钟启动。成功完成一次试验的标准是从起始箱出发沿着跑道移动并进入目标盒从而完全避免电击。为了确保在迷宫中有足够的运动表现，预训练的标准是每只小鼠必须在最多30次试验中，在少于10秒内成功完成13次以上的单向回避试验（未受到电击）。未能达到此标准的小鼠不参加迷宫测试。预训练两小时后，每只小鼠接受15次迷宫试验。小鼠依次进行，直到每只小鼠完成全部15次试验后下一只小鼠才开始其第一次试验，其间有2分钟的ITI。每次试验的最大持续时间为6分钟，如果达到了最大值，小鼠将在其家笼中获得5分钟的恢复期后再进行下一次试验。如果任何小鼠在三次试验中的任意一次未能在6分钟内到达目标盒子，则将从小鼠研究中移除。

在电击动机STM中的测试通过顶部摄像头记录下来，用于在完成15次密集练习试验后的错误计分和运行时间计算。学习的主要衡量指标同样是到达目标盒子所需的潜伏期和犯下的错误数量。此外还记录给予的电击次数。错误同样由实验者在线评分，一次错误定义为小鼠头部完全进入错误路径。

评估指标：

主要测量指标包括小鼠完成任务的潜伏期、犯错次数和移动距离，通过这些数据来评估小鼠的学习和记忆能力。

Fig2 不同年龄段小鼠在STM任务中的表现差异

A) 在水动机小鼠STM获取阶段的5个试验块中的平均错误数。数据显示了在STM任务中，不同年龄的小鼠随着试验次数增加而减少的错误数量，并且特别指出25月龄的老年小鼠相较于5月龄年轻小鼠在某些试验块中有明显更多的错误。

B) 在水动机小鼠STM获取阶段的5个试验块中的平均潜伏期。这部分数据展示小鼠随时间推移在完成任务时速度的变化情况，通常预期随着学习的发生，小鼠会更快地找到正确的路径并到达目标盒子。

C) 对比水动机小鼠STM中最后一次获取试验（第15次试验）和第一次记忆保持试验的平均错误数。

D) 小鼠从加速转棒上跌落前的平均潜伏期，这项测试通常用于评估小鼠的运动协调性和平衡感，它不是直接与STM任务相关的测量，但可以提供有关小鼠整体健康状态和运动功能的信息，因为运动缺陷可能影响小鼠在迷宫中的表现。

结果分析：

实验结果显示所有年龄段的小鼠在STM（短期记忆迷宫）中表现出显著的学习效果，表现为随试验次数增加错误数量和运行时间减少。具体来说，在试验块1中，没有任何一组显示出不同；而在后续的试验块中，12月龄的小鼠组与5月龄的小鼠组相比并没有表现出显著差异。然而，25月龄的老年小鼠组在试验块2和试验块3中犯下的错误明显多于5月龄的年轻小鼠组，这表明老年小鼠的学习能力受损。这些结果强调了随着年龄的增长，学习和记忆功能可能会出现衰退的现象。尽管所有年龄段的小鼠都能够通过重复试验来改善它们的表现，但老年小鼠在STM任务中的表现不如年轻小鼠，特别是在任务的早期阶段。这种现象可能反映了与年龄相关的认知能力下降，这可能是由于大脑老化导致的记忆巩固过程效率降低或其他神经生物学变化。在迷宫中完成任务所需的时间（潜伏期）方面，所有年龄段的小鼠随着练习次数的增加，完成任务的速度加快。不同年龄段的小鼠在完成STM任务时的速度没有因年龄而异。

记忆保持阶段的表现：

在记忆保持阶段，不同年龄段的小鼠在最后的学习试验与第一次的记忆保持试验之间存在显著差异，仅老年组表现出错误增加。具体而言，只有25月龄的老年小鼠在记忆保持阶段的第一个试验中比学习阶段的最后一个试验犯了更多的错误，这可能暗示着记忆保持能力随年龄增长有所下。虽然老年小鼠在STM任务中展示了类似的学习速度，但在记忆保持阶段显示出更高的错误率，特别是在25月龄的老年组中。

注意事项：

尽管小鼠STM为测量学习和记忆提供了宝贵的工具，但它不能被视为Morris水迷宫的直接替代品，因为小鼠STM很可能不依赖于空间学习。不过，使用小鼠STM收集的初步数据表明，由于其具有特定的动机特性，它可能更适合于评估小鼠的学习和记忆。