拟胚体的研究进展概述

原创 医学参考报 干就有未来

撰文│黄 媚

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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拟胚体（embryoid bodies，EBs）是类器官构建的起始，在促进多能干细胞（pluripotent stem cells，PSC） 向三胚层细胞及各种组织器官分化方面，已有多年研究历史。要更好地了解类器官构建，首先得了解EBs。本文就EBs的制备方法、组成与结构，以及EBs的研究进展等方面做简单概述。

一、概述

PSC是一类拥有正常核型，且具有三胚层分化潜能，能自我更新的细胞，包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）等。PSC在体外能分化成多种类型细胞，是研究再生医学和人类发育过程的重要工具。目前，PSC分化潜力的主要挑战是怎样更好地控制其向人们想要的方向分化。

为了研究PSC分化过程，目前广泛使用的一种方法是在体外构建EBs。EBs是PSC在体外悬浮培养因细胞间黏附和重力作用聚集成的球体，为细胞三维聚合物，可部分模拟早期胚胎发育过程，因此被称为“拟胚体”。EBs中3个胚层的细胞互相支持，互相提供生长分化的微环境，有利于PSC体外定向分化。目前利用EBs，已成功将PSC分化成神经细胞、内皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、胰岛细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型。

EBs的大小和状态对体外分化均有较大影响，如何大批量获得大小均一、细胞状态稳定的EBs，是目前体外分化面临的主要难题之一。因此，找到合适的成球方法及时间点进行诱导分化显得十分必要。为了更好地了解EBs及其体外分化过程，方便后续对hPSC体外诱导分化的理解及应用，本文就EBs的制备方法及其组成结构进行简要概述，对EBs在心脏类器官及脑类器官研究中的应用进行较为全面的阐述。

二、EBs的制备与结构

1. EBs的制备方法

目前，制备EBs的方法多种，主要包括悬滴法、促凝胶法、旋转生物反应器法等。

悬滴法是使用较早，使用最广泛的一种方法。该操作方法通常将体外培养的PSC消化成单细胞，后续进行离心、计数，调整PSC单细胞悬液到合适浓度。在培养皿或孔板盖子上，按每滴20～50μl滴加细胞悬液，并保证足够液滴间距防止粘连；在培养皿或孔板中加入DPBS，防止液滴挥发。将培养皿或孔板放入细胞培养箱中培养1～2天，悬滴中的PSC会因重力作用汇聚成细胞球，此时将这些细胞球转移至合适培养容器中进行后续培养。悬滴法能够得到形态较均一的细胞球，并且可以通过悬液内细胞浓度控制球体大小。但具有形成细胞球的数量有限、操作麻烦，并且受外界影响因素比较大等缺点。

促凝胶法也是近几年广泛使用的方法。将适宜密度的PSC单细胞悬液接种至超低黏附的U型底96孔细胞培养板中，离心作用可将培养板中细胞于底部聚集成小团。该方法制备的EBs具有大小和细胞数量可控、均一性好的效果，但存在产量低的缺点。

旋转生物反应器法是大批量制备EBs的理想方法。该方法制备的EBs具有形态、大小较均一的优点。当EBs在反应器内分化培养时，反应器保持稳定低速旋转，这样既能防止干细胞贴壁，也不会对细胞造成损伤，还能够防止细胞球间粘连。通过旋转生物反应器培养的EBs数量， 较传统成球方式，如悬液法、悬滴法，有极大提高。

2. EBs的组成与结构

EBs的组成与结构主要取决于培养条件和添加的诱导因子。一般来说，EBs主要包括内、中、外3个胚层细胞。在体外培养过程中若不添加额外刺激因子，EBs会经历自发分化过程。自发分化前期，EBs包含了原始内胚层与原始外胚层，这些结构与胚胎发育过程中卵圆柱期结构相似，随着时间推移，EBs会形成包含完整内、中、外3个胚层的囊状EBs。但其组成和结构存在较大异质性，且与体内胚胎严格的时空特异性相比，体外EBs中的不同细胞类型分布呈相对无序状态。随着培养时间的增加，EBs干性标志物（OCT4\SOX2\NANOG）的表达逐渐降低，在分化第16天（D16）左右只有微弱表达；三胚层标志物呈先升高后降低的趋势，其中内胚层标志物GATA4在D4左右表达量最高，中胚层标志物MSX1在D8左右表达量最高，外胚层标志物PAX6在D4～D8持续高表达，到了D12天几乎检测不到这些标志物。随着培养时间增加，EBs外层会被自主分泌的一层厚厚的细胞外基质包住。由于这种细胞外基质的存在，培养基中各种生物生长因子、营养物质等难以进入EBs内部，长期将导致EBs内部细胞逐渐死亡，只有相对外层细胞依然保持生物活性。提示经EBs进行的体外定向分化，需要在合适时间点添加相关细胞因子，否则将影响分化效率。

三、EBs的在心、脑类器官中的研究进展

1. EBs在心脏类器官中研究进展

心脏是人胚胎发育过程中第一个行使功能的器官，起源于中胚层，在胚胎发育的第22-23天原始心脏就开始跳动，接着经过膨出、扭曲、位移等过程，逐渐形成心血管系统、房室分隔，到第8周胎儿心血管发育才基本完成。心脏发育是一个极其复杂的过程，包括多种信号通路在时间和空间上的调节。经典Wnt通路的激活为中胚层分化、心肌前体细胞分化和早期心肌增殖所必需，并能够维持心肌前体细胞的增殖；Wnt通路的抑制能促进心肌前体细胞向心肌分化。在心脏发育过程中，原始心脏4个腔室基本形成时，Wnt通路的活性出现空间位置的变化，影响局部心肌细胞增殖。围产期心脏细胞中Wnt通路活性逐渐降低，但为维持心脏正常功能所必需。TGF-β通路也是调控心脏发育的重要通路，骨形态发生蛋白（BMP）和激活素（activin）A为TGF-β超家族蛋白成员，能够与细胞膜上的TGF-β相关受体结合，激活下游信号转导分子Smad1/5/9和Smad2/3，促进心脏分化与形态发生。心脏发育还受到包括Notch等多种通路的调控，这些通路与Wnt、TGF-β相互作用，形成复杂的作用网络，在时间和空间上对胚胎发育进行调控。

心脏类器官是通过体外向EBs培养基中添加特定小因子，将EBs定向分化成具有心肌细胞、心外膜细胞及心内膜细胞等细胞，并能够自主收缩的球体。目前心脏类器官的获得主要通过“两步Wnt”信号通路调节，即前期激活Wnt通路，将EBs诱导至中胚层和心肌祖细胞时期；后期抑制Wnt通路，将心肌祖细胞向心肌细胞特异性分化。值得注意的是在诱导分化过程中，需要对hPSC的最适Wnt激活剂浓度进行摸索，因为每株hPSC对Wnt激活剂的适应性存在较大差异。添加BMP信号通路激活剂（BMP4）有助于心脏类器官体外的形态发生，而抑制BMP信号通路则会导致心脏类器官难以形成腔室结构。在中胚层诱导过程中，适宜的Activin信号激活，有助于后期腔室内部形成一层心内膜细胞，使心脏类器官的结构更加完整。

2. EBs在脑类器官中的研究进展

人脑起始于外胚层，其发育大约在妊娠第3周开始，此时神经管形成，并沿着前后轴分化。在妊娠第6周，由于神经管不同区域细胞增殖率的差异，导致3个脑泡的形成，并最终发育成前脑、中脑和后脑。为了在体外模拟人脑的发育过程，研究人员已经建立了各种全脑或中枢神经系统特定区域的诱导培养体系。脑类器官是由hPSC在体外诱导分化产生的三维聚集体，具有类似于胚胎期人脑的细胞类型和组织结构。目前体外构建脑类器官的方法包括自发分化法和定向诱导法。自发分化是由Lancaster等人开发的，他们将EBs包被在Matrigel中，使用不额外添加诱导因子的神经诱导培养基培养，专注于改善生长条件，从而达到帮助EBs自发分化成脑类器官的目的。该方法可以用于研究不同脑区的相互作用，但存在随机性大、难以控制、难以重复等缺点。定向诱导法指在培养基中额外添加一些特定诱导因子，将EBs定向分化至特定脑区。在前期对EBs使用“双SMAD”抑制剂（SB431542或A83-01、LDN193189或Dorsomorphin），可以将其向神经分化。有趣的是，Wnt信号通路在调节神经干细胞的分化作用中具“两面性”，神经干细胞未被分化出之前，Wnt/β-catenin可抑制胚胎干细胞向其分化，而一旦神经干细胞分化开始，Wnt/β-catenin又可以促进分化过程中早期神经嵴干细胞分化为感觉神经元。在脑类器官分化的后期，通常会在培养基中添加神经营养因子（BDNF、NT3、NGF等），促进神经向终末端分化，形成功能更完善、结构更复杂的神经细胞。

对比心脏类器官和脑类器官的构建，不难发现，不同的信号通路在胚胎发育中发挥着重要的作用，并且其活化和抑制在不同组织中存在较大差异。说明在构建类器官时，首先得了解该器官在体内发育过程，然后才能在体外模拟胚胎发育过程，进而成功构建该类器官。并且EBs的大小对不同胚层的分化潜能存在一定影响。研究中发现脑类器官最适的EBs大小在300μm左右，心脏类器官最适的EBs大小在400μm左右，而体外诱导分化巨噬细胞的最适EBs大小则在800μm左右。

除利用EBs构建类器官外，目前也有大量方法将PSC在平面培养的条件下诱导成各种目的细胞。这两种方式存在各自的优缺点。平面诱导分化的方式具有操作简单，无需特殊设备等优点，但由于平面培养难以模拟组织的复杂结构，此方法获得的细胞种类相对单一，细胞结构与功能也相对较差。而利用EBs构建的类器官，具有多种细胞类型在空间上的有序排列，能够在一定程度上模拟组织的复杂结构，细胞也具备更加完善的功能。

尽管目前利用EBs能构建多种类器官，并且具有该器官的特定功能，其空间结构与体内相似，能够模拟器官的体内发育过程，为疾病的研究及再生医学提供研究平台。但是，目前构建的类器官只能在一定程度上模拟体内发育情况，构建的类器官结构和功能均处于相对不成熟的阶段，无法与成体组织相比。并且，由于培养方法的限制，现在类器官的体积均较小，如脑类器官最大能达到0.5～1.0cm，否则由于缺少血管等系统的营养供给，将导致内部细胞坏死。但总体来说，类器官为疾病研究、药物筛选、新型治疗策略探索、再生医学等各方面均带来了极大促进。

四、总结与展望

EBs是一种类似于胚胎早期发育阶段的细胞团，其组成与结构主要取决于培养条件和诱导因子。一般来说，EBs主要由外胚层、中胚层和内胚层细胞及少量未分化的干细胞组成，这些细胞排列通常无序，不能完全模拟体内胚胎组织结构。EBs的大小和形态，根据成球方法和培养方式，存在较大差异。当培养基中不额外添加诱导因子时，EBs会经历自发分化过程， 干性标志物的表达呈逐渐下降趋势，三胚层标志物先上升后下降，提示定向诱导分化需要在合适时间点进行。

EBs可作为诱导分化的起始，用于制备各种类型细胞和组织，供再生医学和药物筛选等领域使用。通过“两步Wnt”信号通路调节，联合BMP及Activin等通路调控，可以将EBs分化成具有心肌细胞、心外膜细胞及心内膜细胞等，并能自主收缩的心脏类器官。使用“双SMAD”抑制剂，联合Wnt及Notch等信号通路调控，已成功将EBs诱导分化成脑类器官。除此以外，利用EBs还成功构建了肝脏、胰腺、肠道、肾脏、皮肤等多种组织结构的类器官，获得了神经细胞、内皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、软骨细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、周细胞等多种细胞类型。各种类器官及不同细胞可以为组织器官发育研究提供合适平台，为疾病研究提供宝贵材料，也为再生医学研究、药物测试等带来新希望。总之，EBs 研究与应用具有重要的科学意义和临床价值。

（ID: yxckbsc2024050201）

作者简介

黄媚

现任西南地区首家iPSC综合研究与应用平台——成都云测医学生物技术有限公司研发中心iPSC来源细胞药物研究员、iMAC分化组组长，主要负责iPSC向巨噬细胞分化的工艺开发，iPSC 分化为脑类器官来源的间充质干细胞的工艺开发及应用。拥有丰富的干细胞及其产品研究经验。专业方向为肌营养不良蛋白功能缺失对体外心肌细胞分化的影响。以第一作者发表SCI论文2篇，已获授权发明专利2项。

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