脑声常谈丨浅析盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症模型

脓毒症是一种严重的疾病，其特征是全身炎症反应失调，随后出现免疫抑制，这仍然是面临的重大挑战。因此，迫切需要深入研究该疾病的发病机制，以促进新型、更有效的治疗药物的开发。为了研究脓毒症的病理生理学，已经开发了多种动物模型，其中盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的多种微生物脓毒症是最广泛使用的模型，因为它与人类脓毒症的进展和特征非常相似。具体来说，CLP诱导的啮齿动物脓毒症模型显示出具有脓毒症或脓毒性休克典型症状的疾病模式，例如体温过低、心动过速和呼吸急促。CLP 比以前的技术（例如将内毒素甚至纯化的细菌注射到啮齿动物体内）更准确地反映了临床现实。

盲肠结扎和穿刺试验程序

1、使用相同背景的小鼠(C57Bl/6)，雄性，8-10 周龄。雌性小鼠比雄性小鼠对脓毒症引起的死亡具有更强的抵抗力。就CLP后的存活率而言，8 周以上的小鼠比年轻小鼠产生的差异较小。每个比较组大约 N=10 只小鼠应用于生存分析。N=3-5 只小鼠足以进行测定。

2、将动物仰放在干净的工作台面上，使用酒精（70% EtOH 溶液）消毒腹部皮肤。注意：手术区域应彻底剃毛，避免接触皮毛污染伤口。此外，最佳情况下，应使用循环温水垫来维持手术期间麻醉小鼠的正常体温。

3、使用手术刀，在皮肤上平行切开一个小切口，距离中线约1 厘米。尚未渗入腹膜腔。使用小剪刀延长最初的切口。

4、识别腹部肌肉并解剖它们以进入腹膜腔。

5、通过使用钝的解剖钳，识别盲肠并将其移出腹膜腔。小心不要损坏肠系膜血管（这可能导致致命的出血）。

6、结扎60%的盲肠以实现中度败血症，结扎等于或大于盲肠的 75% 通常会导致高度脓毒症，而结扎等于或小于盲肠的 25% 会导致低度脓毒症。小心不要结扎回盲瓣（这可能会阻碍肠道连续性）。

7、在结扎附近通过一个贯穿穿刺（两个孔）对盲肠进行穿孔。穿孔方向应从肠系膜到盲肠的反肠系膜侧，小心不要刺破肠系膜血管。

8、取出针，轻轻挤压结扎的盲肠以确认两个孔是否通畅； 仅少量粪便应从其中排出。

9、将结扎和刺穿的盲肠移入腹膜腔。

10、使用带有切割针的丝质手术缝合线6-0 来闭合腹部肌肉组织。

11、腹腔注射1 ml预热 (37°C)生理盐水以补充手术过程中损失的热量和水分。将小鼠放在热灯下直至复苏。注意：最好使用更安全的加温装置（例如循环温水垫）来代替加热灯。

12、术后注射丁丙诺啡（0.05 mg/kg体重，皮下注射）以实现镇痛。注意：在动物恢复足够的意识以保持胸骨躺卧之前，接受过手术治疗的动物在完全康复之前不应返回到其他动物的笼中。

Fig1CLP诱导的脓毒症中肺和肝的形态学变化

盲肠结扎穿刺（CLP）模型的优点

盲肠结扎穿刺（CLP）方法是一种常用且易于接受的体内脓毒症建模方法，因为它比其他脓毒症模型具有优势。

首先，与其他模型相比，CLP 更好地表示了人类脓毒症的复杂性。CLP 的特点是在中线剖腹手术后在回盲瓣下方结扎，然后针刺盲肠。由于盲肠充满细菌，其穿刺会导致多种微生物腹膜炎、细菌移位进入血液（菌血症）、感染性休克、多器官功能障碍，最后导致死亡。

其次，CLP 的病原体是内源性的，因此类似于导致人类腹膜炎的外伤。此外，CLP 技术满足有效化脓性模型所需的许多基本标准，其制备成本低廉、技术简单等。此外，脓毒症在适应一系列严重程度和测试目标方面具有高度通用性。还可进行以下检测，包括：

临床观察

PK/PD 血液采集

耳朵厚度

生物标志物分析

组织学观察

免疫组织化学

文献引用

Zhang, H.; et al. Role of hydrogen sulfide in cecal ligation and puncture-induced sepsis in the mouse[J]. American Journal of Physiology Lung Cellular Molecular Physiology. 2006, 290(6):L1193.

Siempos II, Lam HC, Ding Y, Choi ME, Choi AM, Ryter SW. Cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice. J Vis Exp. 2014 Feb 9;(84):e51066. doi: 10.3791/51066.

Rivers E, et al. Med shock.N.Engl.J., editor. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med. 2001. pp. 1368-1377.

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