动物行为与电生理专题③丨阿尔茨海默症模型动物脑电分析与行为检测

神经电生理检测是一种可以对大脑的复杂神经活动进行研究的方法。通过此方法研究者能够获取受试者脑部特定脑区或同步获取数个脑区的神经元活动状态。神经电生理检测方法中，局部场电位（LFPs）技术应用最为广泛，该技术可以同时记录的神经元活动较多，并且可以对记录神经元放电活动的进行实时观测。多通道记录技术主要是通过将微丝电极植入到目标脑区，通过目标脑区的微丝电极对所植入的脑区的神经元细胞外的锋电位Spikes（动作电位）信号和局部场电位信号进行采集，采集得到的LFPs信号主要对神经元网络的活动状态进行反映。EEG信号是一种在全脑范围对一段时间内电生理信号的变化进行记录的方法，而LFPs信号是微丝电极对所植入区域一段时间内所有神经元活动的记录，LFPs信号相较于EEG信号具有较高的空间分辨率。脑电信号包含大量不同频段的节律振荡，这些震荡是不同的神经活动的体现，它们在同样认知活动中起到重要的作用。海马神经元网络结构为产生从低频振荡到高频振荡（0.025-600Hz）提供非常适合的框架。认知功能与theta振荡（4-12Hz）和gamma振荡（30-80Hz）这两种节律振荡存在密切联系，这两种节律震荡全部可以从海马区检测到，其中theta振荡一般出现于进行运动时或睡眠快速眼动期（REM），gamma振荡一般表现于认知过程或运动过程中。Akkad等通过在感觉运动皮层上使用经颅交流电刺激来调节运动技能习得期间的theta-gamma活性，发现theta-gamma活性可能是整个大脑学习的常见机制。Smailovic等对AD患者的定量脑电图进行评估，发现AD患者的脑电图中theta和beta频带的测量值减少。与正常个体相比，AD患者的theta功率密度在整个大脑中增加，而beta功率降低。有研究研究发现，视觉皮层中存在由笛卡尔光栅引起gamma节律，这些刺激诱导的gamma节律的功率与认知程度相关。

AD患者的心电及脑电信号存在异变，但异变特征尚不明确，研究AD模型动物的心电以及脑电信号的异变特征以及心脑电信号异变之间的联系有助于从神经电信号异变特征入手识别病症程度。相比于磁共振成像、计算机断层成像、正电子发射型计算机断层显像、认知功能临床筛查、认知评估、脑脊液标志物、血液标志物和基因检测等传统AD检测方法，HRV和EEG可以在日常生活中对AD进行及时预警，及时对患者的神经电生理信号异变进行识别，提示患者对其进行进一步检测，以达到尽早识别AD的目的。

选取广泛应用于痴呆研究的APP/PS1模型小鼠作为模型，利用水迷宫实验对不同月龄AD小鼠学习记忆能进行划分，根据学习记忆能力对模型小鼠的痴呆程度进行划分，利用无创心电采集技术以及多通道记录技术，对小鼠心电及局部场电位信号进行采集，研究不同月龄不同病症程度AD小鼠的心率变异性和局部场电位信号的异变情况。并对AD小鼠的局部场电位信号和心电信号进行同步采集，对采集到的信号进行耦合分析，探究随痴呆程度变化AD小鼠海马区与自主神经系统的之间的联系及其变化特征。

AD小鼠行为学检测

行为学实验使用设备为Morris水迷宫视频分析系统，主要包括图像采集与处理系统、圆形水池和圆形实验平台。水池深度500mm，半径为600mm，水池中放置40mm半径的可移动平台。实验室隔音良好，没有直射光线。为防止环境因素对实验中的小鼠造成影响，使用水池周围围挂窗帘。通过自带的加热系统，对水进行加热，保证水温维持在23℃左右。由于本研究使用的模型动物、水池和平台颜色为黑色，为了保证图像采集系统的识别效率，需要增加对比度，在水中混入奶制品使之呈现白色，同时对平台使用白色织物进行覆盖，平台位于水平面以下5mm处。将圆形水池按方向平均分为为东（East，E）、南（South，S）、西（West，W）和北（North，N）4个象限，平台放置于E象限。在4个象限的池壁中心分别附有不同的形状（如圆形，三角形，正方形和六角星）的视觉线索。在水池上方安装摄像系统使其正对水池，使用图像分析软件对实验数据进行记录处理。

- Morris水迷宫，型号：XR-XM101，上海欣软 -

海马手术植入电极

海马CA1区，使用电动颅骨钻沿着标记坐标开一个0.8mm*0.8mm的矩形窗口，暴露出脑组织，对矩形窗周围用颅骨钻打磨清理，用生理盐水冲洗骨屑。清理干净后可以观察到硬脑膜，用针头将窗口的硬脑膜剥除。在颅骨其他位置分别用颅骨钻钻2个小孔，并拧入螺钉，用于固定电极地线。在手术过程中用生理盐水保持小鼠暴露出的脑组织湿润。第四步：植入电极。将16通道微电极阵列取出，用75%的医用酒精对电极丝尖端进行消毒，再用生理盐水清洗以去掉剩余酒精。使用夹持器对电极进行固定，将电极的地线缠绕至螺钉上。下放电极，使其下端垂直于手术窗口内的大脑皮层，与脑组织表面轻轻接触。利用微电极推进器推进2.0mm，第一次推进300μm再马上抬起来200μm，从而恢复脑组织形变，之后以50μm/1分钟的速度推进至预设深度。第五步：填封。待电极推进至目标深度，窗口内滴入琼脂，以降低使用牙科水泥填封对小鼠造成损伤。将义齿基托树脂液与义齿基托树脂粉混合，混合后得到牙科水泥。待琼脂凝固后，将牙科水泥将电极丝固定在颅骨上，并对地线、螺钉区域进行涂抹固定。待其完全凝固，用生理盐水将覆盖电极的聚乙二醇材料溶解，调节电极位置，继续使用牙科水泥对电极进行固定。将螺钉、地线以及电极完全固定在颅骨上。待其完全凝固，将小鼠从定位仪取下，并用碘伏对小鼠的术后创口进行消毒。术后单笼饲养小鼠，提供充足的食物和饮水，待小鼠恢复两天后，进行LFPs信号采集。

脑电信号采集

对小鼠的静息状态ECG信号进行测量，系统由前置放大器、数据采集平台和记录电脑组成，心电数据采集时设置采样率为1kHz。该系统可以对清醒状态下的小鼠心电信号进行采集，通过小鼠两足同时接触连接在数据采集平台上的电极的正负极，形成回路对小鼠心电信号进行采集。通过信号放大器对采集到的小鼠心电信号进行放大，通过系统配套软件，在电脑上实时观测，并进行心电记录，此系统没有侵入性，并且对小鼠限制较小，消除了目前普遍使用的植入式动物心电采集方法需要对动物进行手术、采集时需要对动物进行固定、注射药品等操作，减少了对动物心理和生理造成影响。使得获取的小鼠ECG信号更加接近自然状态。通过多通道电生理采集系统对自由活动状态下小鼠海马CA1区LFPs信号进行采集，海马16通道原始神经电信号经过连接器通过电缆线输入前置放大器，放大倍数为5000倍，经过A/D转化后传入信号记录系统，原始信号通过40kHz采样，以及0.5~500Hz的带通滤波处理后，得到实验所需的LFPs信号，储存时将采样率设置为1kHz。

- 申请预约试用，小动物无线电生理记录仪，上海欣软 -

心电图采集

采用清醒无创心电图分析系统和多通道在体电生理采集系统共同对其心脑电进行同步采集。实验开始前将连接器与小鼠头部电极相连接，将其至心电采集平台自由活动15分钟，使其适应平台减少应激反应。然后使用清醒无创心电图分析系统和多通道在体电生理采集系统对心电及脑电信号进行观察，待信号稳定后对信号进行记录。记录结束后以同一时间节点为基准对采集到的数据进行截取保存，以获得同步采集的小鼠心电及LFPs信号。

数据分析

对采集到的不同月龄不同痴呆程度小鼠的心电信号，可得到不同病症程度下AD小鼠心电信号的异变特征；

对采集到的不同月龄不同痴呆程度AD组和对照组小鼠海马CA1区的LFPs信号进行分析，研究ripple高频振荡能量和网络连通性的变化，可得到不同病症程度下AD小鼠LFPs信号的异变特征；

将同步采集到的模型小鼠的LFPs信号与心电信号进行耦合分析，探究LFPs与ECG之间的信息传递特性及其随痴呆程度变化的异变特征。

Fig1 5月龄小鼠海马CA1区LFPs时频分布(痴呆未显现组和轻度痴呆组)

文献引用

1.Decreased Global EEG Synchronization in Amyloid Positive Mild Cognitive Impairment and Alzheimer’s Disease Patients—Relationship to APOE ε4[J]. Smailovic Una;Johansson Charlotte;Koenig Thomas;Kåreholt Ingemar;Graff Caroline;Jelic Vesna.Brain Sciences,2021

2.Medial Temporal Lobe Subregional Atrophy in Aging and Alzheimer's Disease: A Longitudinal Study [J]. Chauveau Léa;Kuhn Elizabeth;Palix Cassandre;Felisatti Francesca;Ourry Valentin;de La Sayette Vincent;Chételat Gaël;de Flores Robin.Frontiers in Aging Neuroscience,2021

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5.Object recognition and Morris water maze to detect cognitive impairment from mild hippocampal damage in rats: A reflection based on the literature and experience.[J]. Lissner Lílian Juliana;Wartchow Krista Minéia;Toniazzo Ana Paula;Gonçalves CarlosAlberto;Rodrigues Leticia.Pharmacology, biochemistry, and behavior,2021

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