动物行为与电生理专题①丨啮齿动物睡眠剥夺中的脑电和肌电记录

睡眠剥夺小鼠模型的建立

根据睡眠缺失的情况，一般将睡眠剥夺分为完全睡眠剥夺（TSD）和选择性睡眠剥夺（SSD）。既往研究中TSD一般指至少24h完全睡眠缺失，SSD指睡眠时相的剥夺如REM-SD或NREM-SD。与二者相比，日常生活中人类睡眠剥夺大多介于二者之间，尤其是住院患者、慢性疼痛及失眠人群中经常出现睡眠少于6hTSD。因此，为了最大限度的模拟临床手术患者睡眠剥夺模式，可选择TSD剥夺模式。对于睡眠剥夺方法，以往多采用改良的多平台法制作大鼠睡眠剥夺，此方法主要用于REM睡眠剥夺，对NREM干扰有限，而且由于掉落水中会对动物产生应激影响实验结果。

参考最新TSD相关研究，在饲养小鼠的圆形鼠笼底部安装可旋转的机械装置，其中有一根缓慢旋转的棒产生轻柔、持续的机械刺激避免小鼠睡觉。此装置去除了以往装置中小鼠持续的强迫运动，减少了应激干扰。睡眠剥夺前将小鼠放入仪器中熟悉环境24h，睡眠剥夺期间小鼠自由饮食，剥夺后在仪器中自由睡眠饮食，减少更换饲养环境的干扰。根据文献资料设定剥夺时间为3天，每天9h（AM7:00-PM4:00）。第三天结束后进行行为学测试及相关实验。为了保证此种睡眠剥夺方法的效果，首先通过给小鼠头部置入脑电图（EEG）/肌电图（EMG）监测睡眠情况，确定睡眠剥夺模型构建成功。

- Fig1 睡眠剥夺流程示意图 -

小鼠脑电图（EEG）/肌电图（EMG）置入手术

为记录脑电图（EEG）/肌电图（EMG），首先用电路板及银丝焊接自制电极，双通道脑电与双通道肌电。使用3vol%异氟醚诱导小鼠麻醉，将小鼠固定在脑立体定位仪上。在手术过程中维持吸入浓度在1.2-1.5vol%，剃除小鼠头颈部毛发，碘伏消毒手术部位。用眼科剪从头部开始做一个1.0厘米长的椭圆形切口（前至双眼连线，后至颈部上缘），钝性分离皮下组织，用棉签浸润无菌生理盐水剥离颅骨上粘膜及骨膜充分暴露颅骨。用颅骨钻打孔，注意要钻通颅骨，避免损伤硬脑膜，以免影响EEG记录质量。使用3颗不锈钢螺钉（1×3mm）作为EEG电极，并植入颅骨表面（坐标）：正极（AP:-1.0mm，ML:-1.5mm），负（AP:-2.0mm,ML:1.5mm）和参考电极（AP:-4.0mm,ML:-1.5mm），植入深度约0.5mm。将不锈钢螺丝钉拧转、固定在上述钻好的颅骨孔中，深度以螺丝钉正好越过颅骨为易（螺丝纹2-3圈），出血时可用棉签压迫或生理盐水冲洗。将两条银丝电极埋植于颈部两侧的斜方肌内。用牙科水泥将螺丝钉固定于颅骨表面（注意不要将导电的银丝覆盖）。待牙科水泥固定后，用电烙铁将对应的银丝焊接至自制的电路板，再次用牙科水泥将电路板固定于头部。待完全固定后停止麻醉，小鼠苏醒后放置鼠笼单独饲养，术后恢复一周用于实验。

脑电（EEG）/肌电（EMG）图记录及分析

将置入脑电（EEG）/肌电（EMG）的小鼠放入睡眠剥夺仪中，经过万向轮传至前置放大器，经放大后传至Power Lab生理记录仪系统采集脑电信号，设置采样频率为128Hz。信号滤波设置为：EEG，0.5—50Hz；EMG，30—300Hz。使用Sirenia Sleep Pro软件对脑电信号进行分析，所有脑电波均以10s为一个epoch。NREM脑电图为低频（0.5-4hz范围），高振幅（+/-150-250mv）delta波，低振幅EMG波。REM脑电波以θ波为主（6-9hz范围）、低振幅（+/-50-100mV）和平坦的混合频率肌电图。Wake期脑电图为高频（8~50Hz）、低振幅（+/-50~100mV）、高振幅肌电图。软件分析是半自动化的，首先使用聚类评分设定，根据设定条件软件自动扫描，根据肌电图功率、EEG振幅和频率将一个epoch划分为REM、NREM或Wake状态。自动分析结束后对自动扫描的epoch进行检查，以确保每个epoch都根据定义进行评定，对未进行分析的epoch则手动根据定义评定。

- 多模态信号同步采集（EEG+ECG+EMG+体动）-

小鼠机械痛阈值的测定

所有实验小鼠均在同一行为学房间进行测试，将实验小鼠用有机透明玻璃观察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之间互相干扰）隔开，放置在金属铁丝网上，保持室内安静至少半小时以上，直到小鼠不在出现寻觅、排便等行为时开始测定。使用标准的von Frey纤维丝测定机械痛阈，根据预实验选取测量Von Frey纤维丝分别为0.07、0.16、0.4、0.6、1、1.4和2g。将纤维丝垂直刺激小鼠的右后脚掌心，缓慢用力直到纤维丝微微弯曲（持续1-3s），当小鼠突然回撤爪子或者舔脚掌的行为时记录为阳性反应。痛阈测定时从纤维丝0.6g开始，每个弯曲力刺激5次，三次或三次以上的阳性反应为阳性结果。使用up-and-down方法记录小鼠出现阳性结果的纤维丝对应的克数即为小鼠机械刺痛的阈值。为防止因为频繁刺激影响结果，每次间隔1min左右。刺激时，小鼠出现走动寻觅或者刺激一接触就出现提足行为时，需要等小鼠安静下来再进行测量。

小鼠热刺痛阈值的测定

将实验小鼠用有机透明玻璃观察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之间互相干扰）隔开，放置在热痛测定专用玻璃板上，待小鼠能静止状态时（不四处走动）开始测定。使用热痛仪激光垂直照射小鼠的右后脚掌心，当小鼠出现抬脚或者舔脚的反应则记录为阳性结果，从开始辐射热刺激到出现阳性反应时的时间为缩爪潜伏期（Withdrawal latency）。根据预实验调整辐射热源的强度，使正常小鼠缩爪潜伏期维持在15s左右，并设置切断时间为30s。每只小鼠进行三次实验，每次间隔5min，三次实验所记录时间的平均值即为小鼠的热刺痛阈值。

- 大小鼠足底热刺痛仪，型号：XR1800，上海欣软 -

EEG/EMG记录结果(参数)

首先对旋转棒干扰睡眠的效果进行评价。根据睡眠剥夺实施方案，持续监测记录小鼠的EEG/EMG，分析判断Wake、NREM和REM各阶段的时间。与对照组相比睡眠剥夺组Wake时间明显延长，NREM和REM期几乎被消除。其中Wake期占总时间的96.16%，NREM期占总时间的3.78%，REM占总时间的0.06%。而对照组Wake期占总时间的33.04%，NREM期占总时间的55.12%，REM期占总时间的11.84%。此种睡眠剥夺方法可使小鼠在剥夺期处于几乎完全清醒状态，EEG显示随着睡眠剥夺时间的延长，睡眠压力升高，小鼠进入NREM的尝试更多。

- Fig2 CBD增加睡眠剥夺小鼠睡眠恢复期的觉醒能力 -

文献引用

1.De Gregorio D, McLaughlin RJ, Posa L, et al. Cannabidiol modulatesserotonergic transmission and reverses both allodynia and anxiety-likebehavior in a model of neuropathic pain [J]. Pain, 2019, 160(1): 136-50. 14

2.Reddy DS. Therapeutic and clinical foundations of cannabidiol therapyfor difficult-to-treat seizures in children and adults with refractoryepilepsies [J]. Exp Neurol, 2023, 359:114237.

3.Mlost J, Bryk M, Starowicz K. Cannabidiol for Pain Treatment: Focuson Pharmacology and Mechanism of Action [J]. Int J Mol Sci. 2020Nov 23;21(22):8870.

Razavi Y, Rashvand M, Sharifi A, et al. Cannabidiol microinjectioninto the nucleus accumbens attenuated nociceptive behaviors inananimal model of tonic pain [J]. Neurosci Lett, 2021, 762:136141.

4.Murillo-Rodríguez E, Palomero-Rivero M, Millán-Aldaco D, et al. Effects on sleep and dopamine levels of microdialysis perfusionofcannabidiol into the lateral hypothalamus of rats [J]. Life sciences, 2011, 88(11-12): 504-11.

5.朱康生.伏隔核多巴胺受体神经元参与睡眠剥夺导致痛觉过敏的机制及大麻二酚的干预作用研究[D].河北医科大学,2023.

6.Varallo G, Giusti EM, Manna C, et al. Sleep disturbances andsleepdisorders as risk factors for chronic postsurgical pain: Asystematicreview and meta-analysis [J]. Sleep Med Rev, 2022, 63:101630.

7.Wei Y, Colombo MA, Ramautar JR, et al. Sleep Stage TransitionDynamics Reveal Specific Stage 2 Vulnerability in Insomnia [J]. Sleep. 2017 Sep 1;40(9).

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