Sci Adv丨清醒与麻醉：揭示麻醉状态如何重塑听觉脑干的神经活动

现代感觉神经生理学已经转向使用清醒动物，以避免麻醉剂对神经反应特性的影响，这些影响在丘脑和皮层阶段比以前认为的要大得多。然而，这种实验实践的转变主要集中在包括皮层cortex、丘脑thalamus和上丘colliculus在内的高级处理阶段，而对于位于脑干深处的早期感觉区域，现有的大部分认知仍然依赖于在麻醉下进行的记录。近年来，细胞外记录甚至成像技术的进步使得在清醒条件下访问脑干成为可能，包括在耳蜗核（听觉系统的第一个中继站）中的开创性记录。这些研究表明，清醒状态下早期听觉系统的声音调谐特性与麻醉状态下观察到的相似，尽管在麻醉状态下自发活动明显减少，反应阈值略有增加，这与去脑和瘫痪猫的早期观察一致。然而，这些结论并不是基于同一神经元在不同状态下的声音表征的直接比较，这对于确定麻醉状态下感觉编码是否一对一保留是必要的。听觉神经生理学中最常用的全身麻醉剂是吸入麻醉剂（主要是异氟烷）和与镇静剂（赛拉嗪或美托咪定）结合使用的氯胺酮。吸入麻醉剂和镇静剂通过作用于GABA（γ-氨基丁酸, γ-aminobutyric acid）受体强烈增强抑制电流，而氯胺酮则阻断N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-d-aspartate, NMDA）电流。在网络规模上应用时，这可能导致兴奋-抑制平衡的大幅度变化，从而导致网络动态和刺激驱动反应的深刻变化。然而，麻醉对早期感觉网络的强大网络规模效应的存在研究甚少。

巴黎西岱大学和巴斯德研究所的Brice Bathellier团队在Science Advanves上发表文章Massive perturbation of sound representations by anesthesia in the auditory brainstem，通过在小鼠的耳蜗核中使用线性多电极阵列（Neuropixels 1.0）进行细胞外记录，其涵盖清醒和异氟烷麻醉状态下的大范围声音，进而广泛地探测两种状态下的声音表征结构。研究团队观察到麻醉状态下尖峰统计数据发生了显著变化，自发放电率大幅降低，揭示了麻醉对单个神经元功能特性的修改远超之前描述的效果，许多在清醒状态下反应微弱或无反应的神经元在麻醉状态下变得对声音高度敏感，反之亦然；这些变化修改了群体水平的神经编码，可能导致在麻醉状态下听觉皮层下游观察到的声音相关信息减少。

图源 Science Advances

首先，为了能在清醒的小鼠中访问耳蜗核，研究人员训练小鼠在头部固定的情况下保持安静，并依赖于此，研究人员得以将Neuropixels 1.0探针以预定的角度和进入点插入小鼠头部。通过反复穿刺直到检测到与声音同步的反应来微调探针定位，记录可以连续进行3天，在4只小鼠中共获得了7次记录。在最后一次记录后，通过荧光染料标记的电极轨迹进行组织学鉴定确定探针的确切位置，其中5次记录针对后腹耳蜗核（postero-ventral cochlear nucleus, PVCN），2次针对背耳蜗核（dorsal cochlear nucleus, DCN）。在小鼠清醒状态下（80分钟）和1.1%异氟烷麻醉状态下记录耳蜗核的活动。通过观察原始电压波形，可以清楚地看到清醒和麻醉状态下脑活动模式的变化，而在麻醉状态下高频波动的幅度显著下降。通过计算高频波动的中位绝对偏差量化这一变化，麻醉状态下高频波动减少了2到4倍。高频波动的幅度主要对应于细胞外动作电位的总和，通常与局部群体放电率呈亚线性关系。因此，可以估计清醒和麻醉状态下群体放电率减少了三倍以上，这与之前使用不同麻醉协议的报告一致。

图1 清醒和麻醉状态下小鼠耳蜗核神经元的电生理记录

这种活动模式的巨大变化对提取单一神经元活动的尖峰分类性能产生了强烈影响。研究团队应用Kilosort 2.5对清醒和麻醉数据集进行分类，发现麻醉状态下检测到的尖峰显著减少。然而，数据的视觉检查显示，许多明显的尖峰波形在麻醉期间未被分配到任何簇。研究团队调整了两种方法来优化不同状态下的神经元跟踪。首先，分别对每种状态进行尖峰分类，然后根据波形相似性匹配检测到的单元，此方法在麻醉和清醒状态下分别检测到173和163个单元，但只有18个单元在两种状态下匹配。其次，通过在麻醉数据上定义初始模板并在整个会话中应用宽松参数，直接跟踪两种状态下的神经元，此方法在两种状态下跟踪了163个单元。尽管尖峰分类存在困难，研究团队成功地跟踪了相同单元的活动，生成了两个数据集：一个具有高可靠性但跨状态跟踪的单元较少，另一个具有更多但可靠性较低的单元。

图2 麻醉带来的广泛活动变化会影响尖峰排序

为了验证这两个尖峰分类数据集，研究团队将清醒和麻醉状态作为两个独立的数据集，确认了异氟烷麻醉对耳蜗核的影响。多项研究表明，麻醉状态下自发放电率显著下降，导致清醒状态下明显的负反应消失。这些研究还报告了纯音反应的调谐宽度变窄和强度阈值升高。研究数据显示，当没有声音呈现时，自发活动的显著减少在光栅图中清晰可见。通过计算每个单元在所有约2秒间隔内的自发放电率，可以发现麻醉状态下的放电率分布向低放电率偏移，且清醒状态下69%（split s.s.）和51%（consensus s.s.）的单元自发放电率超过1 Hz，而麻醉状态下仅为20%和16%。相比之下，清醒状态下只有1%和2%的单元没有自发尖峰，而麻醉状态下分别为47%和32%。这些观察结果与之前的报告一致，即麻醉状态下，自发活动减少导致声音驱动的放电率降低消失，并且尽管自发网络动态发生了巨大变化，异氟烷麻醉下对声音的正反应仍然清晰可见。研究团队还发现，麻醉略微减少了对高频率的调谐，但这种减少并不显著。调谐曲线的半宽度显示，清醒状态下的调谐略宽于麻醉状态。这一效应在低强度下更明显，表明麻醉下调谐宽度的减少可能与声音强度阈值增加有关。

图3 麻醉剂能降低神经元自发放电和声音诱发的抑制反应

图4 麻醉会使频率调谐变得更加敏锐，并提高强度阈值

研究团队对比了麻醉对自发活动和声音反应的不同影响，进一步探讨了两种状态下的声音表征，通过绘制单细胞调谐曲线，发现单细胞水平的响应变化比平均群体特性更显著。一些神经元仅在一种状态下有反应：清醒状态下对纯音调谐明显的神经元在麻醉状态下几乎没有反应，反之亦然；还有一些神经元在清醒状态下被声音抑制，而在麻醉状态下被激发。麻醉状态下自发活动减少，导致抑制性反应的神经元数量极少。尽管如此，某些神经元在两种状态下的响应变化较小。基于Mann-Whitney U检验，研究团队发现，在split s.s.和consensus s.s.数据集中，分别有18/18和129/163个神经元在最佳频率（BF）下有显著响应。麻醉状态下，24/129个神经元在BF下的放电显著减少，34/129个显著增加，35/129个响应符号显著变化，36/129个在两种状态下没有显著变化。麻醉状态下响应较大的神经元并非由于清醒状态下漏检的尖峰。研究团队还发现，麻醉主要影响神经元是否参与表征，而非其代表的频率。为了验证这一结果是否适用于其他麻醉剂，研究团队使用氯胺酮-美托咪定进行实验，发现清醒状态下自发活动显著增加，尽管不如异氟烷显著，这表明这种效应并不局限于异氟烷。

图5 在不同状态下追踪神经元对声音反应的大量调节

图6 异氟醚麻醉会改变声音信息在耳蜗核神经元中的分布方式

在该研究中，研究人员设计了一个声音刺激实验，即在清醒和异氟烷麻醉状态下，向小鼠呈现一系列声音刺激，包括纯音、调幅或调频声音以及复杂声音，记录耳蜗核的神经活动。具体而言，研究团队首先使用Python生成声音，并通过Matlab以192 kHz的频率传输，将声音传输到放置在小鼠前方10至15厘米处的放大自由场扬声器，且声音强度在开始和结束时以10毫秒的余弦斜坡方式（cosine ramped）变化，以避免频谱扩散。将头部固定的小鼠使用隔音箱隔离，以减少外部噪音。研究团队向小鼠呈现了两组声音。第一组包括307个短声音（500毫秒），每个声音重复12次，随机顺序播放，声音间隔1秒。声音包括28个纯音、26个线性强度变化的声音、48个和弦、20个频率扫频、30个带通白噪声、48个调幅声音、60个复杂声音和47个分解声音。第二组包括10个自然声音样本，每个样本播放两次，间隔在短声音块之间。首先在清醒状态下（80分钟）呈现声音，然后通过鼻罩快速诱导2%异氟烷麻醉，随后将浓度降低到1.1%。整个过程中通过红外视频监控麻醉的连续性。麻醉状态下再次呈现声音集，然后移除鼻罩让小鼠醒来。研究人员将收集到的数据通过尖峰分类算法（Kilosort 2.5）对清醒和麻醉状态下的神经元活动进行分类和比较，分析麻醉对神经元响应特性的影响。

该研究指出，麻醉对耳蜗核神经元的自发活动和声音响应有显著影响，麻醉状态下自发放电率显著降低，导致声音驱动的负反应消失，但对声音的正反应仍然存在。麻醉还会改变神经元的功能特性，使得一些在清醒状态下无反应的神经元在麻醉状态下变得高度敏感，反之亦然。未来的研究可以深入探讨不同麻醉剂对听觉系统的影响，并研究这些变化对听觉信息处理的长期影响。该研究将有助于更好地理解麻醉对神经系统的广泛影响，并改进神经科学研究中的实验方法。

原文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado2291#sec-4

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