Nat Commun | 急性应激时如何快速升高血糖？刘际团队发现HSL轴调节

快速的葡萄糖供应对动物在应激反应中的生存至关重要。下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元如何精确控制应激诱导的葡萄糖释放的时间尺度尚不清楚。

2024年10月5日，中国科学技术大学信息科学与技术学院刘际团队在Nature Communications 上发表题为《Hypothalamus-sympathetic-liver axis mediates the early phase of stress-induced hyperglycemia in the male mice 》的论文，在该研究中，作者发现应激性高血糖在雄性小鼠中至少可以分为两个阶段:第一个快速阶段是由下丘脑(室旁到腹内侧下丘脑)-交感神经(白斑中缝核到中外侧核)-肝(HSL)轴活动介导的;第二个延迟阶段是由肾上腺活动介导的。阻断HSL轴的活性可削弱捕食诱发的逃跑反应，表明HSL通路的活性是应对应激所必需的。作者进一步揭示了下丘脑CRH信号的胞内级联，该级联是由GABAA受体β3亚基在S408/409位点磷酸化介导的，从而阻止GABAA受体膜募集。因此，作者揭示了应激时葡萄糖供应的精确时间尺度，分别由肾上腺非依赖性HSL和肾上腺依赖性途径介导。

急性应激时，CRH调节快速和延迟的葡萄糖释放

当面对压力源时，PVN中的CRH神经元被激活，导致肾上腺释放皮质酮。作者首先询问PVN中的CRH神经元是否调节葡萄糖水平。为避免摄食引起的血糖变化，实验前禁食小鼠12小时。通过化学遗传学方法作者发现，给药DREADD配体CNO显著增加CRH神经元的放电率和CRH神经元中c-fos的表达。

与对照组相比，腹腔注射CNO导致实验组血糖水平升高。为了进一步证实结果，作者采用光遗传学方法探究PVNCRH神经元的活性。正如预期的那样，脑切片的体外电生理记录显示，当暴露于蓝光时，PVNCRH神经元的活性增加。与化学遗传学数据一致，光刺激CRH神经元导致血糖水平和皮质酮水平显著升高，这表明PVNCRH神经元的激活确实能够调节葡萄糖水平。

PVNCRH-VMH投射是应激时葡萄糖快速释放所必需的

为了探索CRH神经元可能的下游靶点，作者化学激活了PVNCRH神经元，并对神经元活性标记物c-Fos进行了免疫染色。刺激PVNCRH神经元显著增加PVNCRH神经元中c-fos阳性细胞数量。有趣的是，作者还发现VMH中c- fos表达增加。SF-1在VMH中特异性表达。为了进一步测试VMH神经元是否参与应激反应，作者通过光纤记录钙信号发现在对急性身体应激(包括足部冲击、水喷雾和尾夹)的反应中，总体Ca2+信号变化20%(用ΔF/F表示)。这表明VMHSF-1神经元确实参与了应激反应。

应激时由VMHCRHR2介导CRH启动的葡萄糖快速释放

CRHR1和CRHR2均广泛分布于大脑中，而VMH中CRH受体亚型以CRHR2为主。为了研究CRHR2是否在应激反应中负责葡萄糖调节，作者将不同的CRH受体拮抗剂注入VMH并测量血糖变化。应用CRHR1拮抗剂R121919显示血糖水平适度变化，而CRHR2拮抗剂Astressin2B与溶剂组相比，在足部休克应激期间阻断了葡萄糖的快速增加。同样，Astressin2B在面对水喷、尾夹等其他应激源时，阻断了葡萄糖的快速升高，但不阻断延迟期，证实了应激反应中CRH信号介导的高血糖主要是通过VMH中CRHR2的激活介导的。当作者将AAV-DIO-GFP注射到Sf-1-Cre小鼠中标记VMH神经元并使用特异性反义寡核苷酸检测CRHR2 mRNA时，作者发现大量的CRHR2 mRNA在VMH背内侧表达。

CRH通过VMH中β3 GABAA受体亚基调节抑制性突触传递

作者发现CRH刺激VMH神经元的活动。然而，这种兴奋作用是否由突触传递介导尚不清楚。为了回答这个问题，作者采用电压钳法记录VMHSF-1神经元的突触后电流。CRH的应用不影响自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)。而灌注GABAA受体拮抗剂PTX阻断了CRH对动作电位放电的作用，表明抑制电流可能介导了CRH对VMH神经元活性的影响。事实上，CRH显著降低了自发抑制性突触后电流(sIPSCs)的振幅和频率。同样，敲除VMHSF-1神经元中CRHr2表达完全降低了CRH诱导的sIPSC幅度和频率抑制，提示CRHR2激活可抑制SF-1神经元的抑制性张力。

为了可视化GABAARs的细胞表面动力学，作者在N2a细胞系中表达pHluorin(一种ph敏感的GFP变体)标记的GABAAR亚基(β3和γ2)和CRHR2，以实时测量受体的迁移率。作者发现，响应CRH， β3 GABAAR亚基减少，而γ2亚基表达细胞没有发现显著变化。这一结果表明，含有β3亚基的GABAAR亚单位是CRH细胞内信号通路的特异性靶点。先前的研究表明，GABAAR亚基的膜转运很可能通过其胞内域的磷酸化来调节，特别是β3亚基的Ser408/409磷酸化位点。作者发现CRH给药后，Ser408/409的磷酸化程度显著增加。这些数据强烈表明，β3 GABAAR亚单位的Ser408/409磷酸化位点是VMH中CRH信号通路的特异性靶点。

下丘脑CRH信号通过HSL轴活性调控葡萄糖的快速释放

作者之前的研究表明VMH可以通过交感神经通路控制葡萄糖代谢。作者假设VMHCRHR2调节应激诱导的葡萄糖释放可以通过交感神经传入肝脏介导。为了验证这一假设，作者使用CRISPR-Cas9系统构建了CRHr2-Cre小鼠。首先，作者通过在CRHr2-Cre小鼠的VMH中注射顺行失踪病毒发现，在脑干区域，包括迷走神经背运动核(DMV)和苍白中缝核(Rpa)，发现密集的标记终末，在孤束核(NTS)中发现少量纤维。光刺激VMHCRHR2 - Rpa通路可显著提高血糖。

为了测试VMHCRHR2是否与Rpa神经元形成单突触连接，作者在CRHR2神经元中表达AAV-DIO-ChR2。在蓝光照射下，Rpa神经元中发现了时间锁定的突触后兴奋电流，该电流可被突触前阻断剂TTX阻断，并被TTX + 4-AP恢复，表明VMHCRHR2与Rpa神经元之间存在单突触连接。

HSL轴介导的快速葡萄糖释放对于捕食诱导的飞行反应是必需的

为了进一步证实下丘脑CRH信号与肝脏之间的直接联系，作者在Sf-1-Cre小鼠的VMH中注射了AAV-DIO-mCherry，并在肝脏中注射了跨突触逆行示迹剂伪狂犬病毒(PRV)。作者在VMH中发现了大量的GFP+神经元，它们与mCherry标记的SF-1共定位，表明VMH-肝脏存在连接。在PVN中，作者还发现了gfplar标记的肝脏PRV的共定位和CRH的免疫染色，表明PVNCRH -肝脏存在投射。接下来，作者发现HSL轴活性在应激反应的早期(0-3分钟)是必需的，而肾上腺活性在应激反应的后期(3分钟)葡萄糖释放是必需的。

当面临潜在威胁时，快速能量供应对于动物的生存至关重要。接下来，作者想知道VMH中的CRH信号是否对于捕食性线索诱导的飞行反应是必需的。为了验证这一假设，作者在VMH中注射了CRHR2拮抗剂Astressin2B。在模拟接近的捕食者时，动物会开始逃逸并躲进巢穴。当通过局部注射Astressin2B阻断VMH中的CRH信号时，作者发现逃离巢穴的潜伏期延长，飞行速度降低。这表明VMH中的CRHR2对于捕食性线索诱导的飞行反应是必要的。

总结

在本研究中，作者定义了一个下丘脑-交感-肝脏轴，它在应激反应期间独立于肾上腺活动而介导快速葡萄糖释放。应激信号通过CRHR2介导的β3 GABAA受体膜招募来调节抑制性张力，从而整合到VMH中，作为血糖水平的中枢控制。

总之，作者发现应激肽CRH启动了由快速和延迟两个阶段组成的葡萄糖释放过程，分别由HSL和肾上腺激素调节。早期阶段由PVN-VMH-Rpa-交感神经系统介导，在急性应激期间维持快速的葡萄糖供应，这对动物在面对应激源时的生存至关重要。

找实验方法，上脑声常谈。