贝锦新团队解析三级淋巴结构在鼻咽癌肿瘤进展及免疫治疗作用

癌症组织中常见免疫细胞浸润，其与肿瘤细胞、间质细胞等共同构成肿瘤微环境（TME）。三级淋巴结构（TLS）是免疫细胞在炎症、感染或肿瘤组织中形成的有序异位区域结构。以往研究发现了构成肿瘤TLS的主要细胞种类，包括T细胞、B细胞、抗原呈递细胞（APCs）、支持性的间质细胞和滤泡树突状细胞（FDC）。近期，利用单细胞和空间转录组学在卵巢癌、头颈鳞癌、肾癌等研究进一步揭示了TLS中存在包括CXCL13+ T辅助细胞、SEMA4A+生发中心B细胞和CXCL12+成纤维细胞等关键细胞亚群。这些结果说明TLS组成复杂并存在广泛的异质性。已有研究证实，TLS及其组分在抑制肿瘤进展和促进免疫治疗反应中发挥重要作用，但TLS如何形成及其发挥作用机制尚未清楚。

2024年9月4日，广东省精准医学应用学会单细胞科技分会主任委员、中山大学肿瘤防治中心贝锦新教授及其团队在《Nature Communications》发表了题为《Single-Cell and Spatial Transcriptome Analyses Reveal Tertiary Lymphoid Structures Linked to Tumour Progression and Immunotherapy Response in Nasopharyngeal Carcinoma》的研究论文。该研究以鼻咽癌（NPC）为模型，首次系统解析了单细胞和空间水平上肿瘤内TLS的细胞组成及抗肿瘤作用机制，为肿瘤患者免疫治疗提供了新的靶点，为预测肿瘤免疫治疗疗效提供有效工具。

NPC肿瘤微环境以EB病毒（EBV）感染肿瘤细胞和大量免疫细胞的浸润为主要特点。该团队针对NPC不同分期、免疫检查点抑制剂治疗响应差异等临床现象，利用10x Genomics 5' 单细胞转录组、免疫组库（VDJ）测序以及Stereo-seq和Visium空间单细胞转录组测序等技术，解析NPC肿瘤组织内TLS的细胞组成，详细刻画了肿瘤进展、免疫治疗响应相关的肿瘤TLS组成变化，解析了其抗肿瘤作用机制，并且通过细胞共培养实验、生存分析、多重免疫组化和相关公共转录组数据集等方法验证了重要的发现（图1）。

图1. 整体研究设计

研究人员首先利用单细胞转录组测序技术鉴定了NPC肿瘤组织中五个具有典型TLS标记物的细胞亚群，包括生发中心（GC）B细胞（CD19, MS4A1, RGS13, AICDA, BCL6；明区和暗区）、CD4+CXCR5+ T滤泡辅助细胞（CD4, CXCR5, CXCL13, BCL6）、CXCL13+CD8+ T细胞（CD8A, CXCR5, CXCL13, BCL6）以及CXCL13+肿瘤相关成纤维（CAFs）细胞（COL1A1, CXCL13, CCL19, CCL21），进一步利用Stereo-seq和Visium空间转录组测序技术验证了上述细胞亚群空间位于TLS内。

针对TLS中GC B细胞的关键角色，研究人员通过拟时序分化轨迹分析揭示了幼稚B细胞向记忆B细胞、GC B细胞和浆细胞的分化过程。研究发现，生发中心反应所生成的浆细胞可能是抗肿瘤抗体的重要来源。然而，通过一系列生物信息学分析，研究人员观察到，相较于早期NPC，在晚期NPC中GC B细胞与浆细胞之间的相同BCR克隆型转换减少，浆细胞所产生的IgA和IgG抗体水平显著较低；并且，低GC B细胞比例和抗体水平与患者不良预后相关。这些结果表明，随着肿瘤进展，经历生发中心反应的浆细胞抗体产生减少，进而不利于NPC患者的预后。进一步研究表明，NPC中的浆细胞与NK细胞和巨噬细胞紧密共定位，可能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC；NK细胞）和抗体依赖性细胞吞噬（ADCP；巨噬细胞）作用促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤效应。研究还发现，NPC内浆细胞的数量与高表达EBV相关分子的恶性细胞亚群（具有更强免疫抑制功能）呈负相关。通过定量分析空间转录组和多重免疫组化数据，研究人员发现浆细胞分泌的抗体通过ADCC和ADCP机制促进了高表达EBV相关分子恶性细胞的凋亡。这一过程对解除NPC的免疫抑制微环境以及改善NPC患者对免疫治疗的响应具有重要意义。此外，研究还定义了肿瘤细胞聚集区域（TCA），根据其中EBV相关分子和浆细胞分布，能够将NPC肿瘤分为四类，发现TCA表达高水平EBV相关分子和具有较多浆细胞浸润的亚型（EBVhigh-TCA-wP）预后最好（图2）。

该研究发现TLS相关CXCL13+CAFs通过CXCL13-CXCR5、VCAM1-整合素、ICAM1-整合素等配体-受体对与B细胞进行相互作用，并通过ST分析、多重免疫组化分析及体外细胞共培养实验进一步证实了CXCL13+CAFs促进B细胞趋化、粘附以及分化和成熟。这些发现表明CXCL13+CAFs在促进NPC患者免疫应答和改善预后中扮演了重要角色。

研究者还发现TLS相关的CXCL13+CD8+ T细胞在识别和攻击肿瘤细胞中可能发挥关键作用。此外，研究还发现CXCL13+CD8+ T细胞在早期肿瘤中的比例显著高于晚期肿瘤，凸显了它们在肿瘤早期阶段发挥抗肿瘤潜力。这些发现表明在晚期肿瘤中增加CXCL13+CD8+ T细胞含量可能有助于提高抗肿瘤治疗效果，为治疗晚期肿瘤提了供新的策略。

最后，在NPC中与肿瘤TLS相关的细胞亚群通过配体-受体相互作用形成了一个免疫活化微环境，这与患者的预后密切相关。生存分析显示，具有高TLS细胞标志（TLS-CS）的患者比低TLS-CS的患者呈现显著更好的预后。此外，多重免疫组化染色验证了含有TLS的样本中免疫细胞浸润程度更高，与患者更好的预后关联，强调了TLS作为预后指标的独立作用。这些研究结果表明，TLS中的关键细胞亚群不仅在NPC的肿瘤微环境中创建了一个免疫活化的区域，而且显著影响患者的预后和对免疫治疗的响应。这些发现再次强调了维持或增强这种免疫微环境的潜在治疗价值。

总之，该研究首次利用高发于我国的EBV感染相关鼻咽癌，在单细胞和空间水平高分辨率上解析了肿瘤TLS细胞组成异质性，鉴定了构成TLS结构的重要细胞亚群及分子特征，阐明了TLS抑制肿瘤进展和促进免疫治疗反应的机制（图2），为基于TLS的肿瘤分子分型和免疫治疗提供了新的策略。

图2. 鼻咽癌免疫治疗响应及非响应患者肿瘤组织细胞组分示意图

中山大学肿瘤防治中心刘洋博士、何帅副研究员、迟冬梅主治医生和王秀芝博士后、中山大学附属第八医院叶双燕博士为本文的共同第一作者，中山大学肿瘤防治中心贝锦新教授为通讯作者。相关研究成果已申请专利，将进一步推动成果临床转化应用，保障人民健康。

该研究获得国家自然科学基金与澳门科学技术发展基金（FDCT-NSFC；82261160657）、国家重点研发计划（NKRDPC；2022YFC3400901）、国家自然科学基金（82130078）、广州市科技计划项目基金（201707020039）、广东省创新创业团队计划（2016ZT06S638）等资助。

贝锦新课题组主要从事精准医学和转化医学研究，围绕肿瘤精准医学的核心理念，利用个体和单细胞水平的基因组、表达谱等多层次、多组学信息，挖掘与肿瘤发生发展及其异质性相关的分子、细胞及其作用网络，研究候选分子、细胞调控肿瘤进展的重要机制，发现与肿瘤早期精准诊断相关的分子标志物，筛选针对肿瘤微环境演进关键事件的精准诊治靶标，为实现肿瘤的个体化防诊治提供有效解决方案。至今发表SCI论文100余篇，其中包括国际顶级专业杂志Cell、Lancet Oncology、Nature Genetics、Advanced Science、Genome Biology、Nature Communications等。团队拥有高通量测序及基因分型、单细胞组学平台（10X Genomics联合实验室）、高性能计算集群等平台，所在依托单位拥有先进的动物、细胞、分子水平相关研究平台。课题组经费充足、科研氛围浓厚、团队成员关系融洽。课题组长期招聘各类科研人员，欢迎对相关领域感兴趣的博士后，博士生加入。

论文详情请查阅：https://doi.org/10.1038/s41467-024-52153-4