散斑血流成像专题⑪丨急性后肢缺血模型

鼠急性后肢缺血模型通常是通过快速闭塞后肢动脉构建。后肢动脉的闭塞常通过结扎、电凝、介入栓塞、光化学栓塞和物理或化学损伤等手段来完成。以上不同的急性后肢缺血模型造模方法之间有着很大不同,并且同一造模方法下也可能存在着数种不同的造模方式。

鼠后肢动脉结扎

鼠后肢动脉结扎是使用最广泛的造模方法，该方法通常从鼠一侧后肢内侧切口,暴露后肢动脉并于结扎后离断以达到后肢缺血。另一侧后肢作为对照用于造模评价中的对比而不进行手术操作。鼠后肢动脉结扎因结扎方式、结扎次数、结扎位置以及离断与否而存在着多种不同的造模方式,同时也因上述因素造成了鼠后肢缺血模型血流恢复和血管新生模式的差异。

根据结扎方式的不同可分为不可吸收尼龙线结扎法和电凝闭塞法。而根据结扎次数可分为单次结扎和双重结扎,也就是指结扎后肢动脉中的一支或两支,如单次股动脉结扎和股动脉与髂总动脉双重结扎。双重结扎比单次结扎造成的后肢缺血更严重,恢复时间也会更长。当然,不同的结扎位置也导致鼠后肢缺血情况的差异。现有的手术方法通常侧重于髂动脉、股动脉及其分支的结扎，其中部分手术方法对目标动脉周围静脉和神经进行了剥离。还有,对于双重结扎后是否离断两结扎部位间的血管,决定了模型的实验用途,如股动脉双重结扎离断术后的模型就不适用于评估动脉生成,但十分适合用于评估缺血性远端组织的血管生成。

根据结扎方式、结扎次数、结扎位置和离断与否对现有的鼠后肢动脉结扎模型进行分类,其方法主要包括单次股动脉电凝或结扎、单次髂总动静脉电凝或结扎、单次髂总动脉电凝或结扎、股动脉与髂总动脉双重电凝、股动脉双重电凝或结扎离断以及髂外动静脉和股动静脉双重结扎离断术。这6种手术除了结扎方式、结扎次数、结扎位置以及离断与否不同外,手术操作手法基本相似,都是从腹部或腹股沟附近进行切开,暴露并游离出目标血管进行操作。该造模方法所使用的鼠类较为广泛,包括C57BL/6小鼠、C57BL/6遗传背景的基因敲除小鼠、BALB/c小鼠、Lewis大鼠和Wistar大鼠。根据不同的PAD类型,研究者还会在鼠动脉结扎前对其进行干预已达到接近临床疾病,如下肢动脉硬化闭塞症模型会使用高脂高能饲料喂饲载脂蛋白E(apolipoproteinE,ApoE)基因敲除小鼠后手术,以及糖尿病性下肢缺血会先建立糖尿病鼠模型后再手术。

介入栓塞

介入操作也因其创伤较小,对实验动物整体及局部影响较弱而备受关注。在鼠后肢缺血模型中,已有不少研究使用介入栓塞的方法进行造模。其中大鼠因下肢动脉管腔较粗,容易行介入操作,颇受研究者的青睐,如Lewis大鼠和SD大鼠于既往文献中被用来造模。介入栓塞法是通过鼠颈动脉将导管送入,在造影引导下至髂动脉和尾部上腹部上动脉间,注射栓塞剂对局部血管进行栓塞以造成组织缺血。既往用作栓塞剂的有水凝胶线、聚乙烯醇颗粒和N-丁基氰基丙烯酸酯。其中,水凝胶线是介入栓塞中使用最广泛的栓塞剂。

光化学栓塞

光化学栓塞是通过光化学反应诱导的后肢血栓形成,进而造成后肢缺血的一种新型造模方法。既往文献使用ICR小鼠和Wistar大鼠,通过给鼠尾静脉注射光敏剂,再使用特定光源照射一段时间后诱导局部动脉血栓形成。常用的光敏剂有赤藓红B和孟加拉玫瑰红,注射上述光敏剂后分别使用冷白光或过滤绿光照射小鼠目标动脉30~40min诱导血栓形成。光敏剂可损害血管内皮并在照明后的最初几分钟内诱导局部血小板聚集而形成血栓。该方法可以通过改变光束位置、强度和光敏剂浓度来控制血栓大小及位置。

化学损伤

有研究首次使用SD大鼠验证了氯化铁直接作用于动脉表面会迅速诱导动脉内富含血小板的血栓形成。在氯化铁的刺激下通常会进展为完全性血栓闭塞,进而完成后肢缺血模型造模。一般在解剖显微镜下,在目标动脉上包裹一块浸泡过氯化铁(10%~50%)的滤纸(约1~2mm)。滤纸包裹动脉时长约为3min,随后取下。此时动脉内血栓逐渐形成,最终导致血管完全闭塞。既往文献中也曾使用基因敲除小鼠进行造模,如P2Y12基因敲除小鼠和白细胞相关免疫球蛋白样受体基因敲除小鼠。

物理损伤

现有的物理损伤法通常包括机械损伤和电损伤,二者都是通过物理手段对动脉血管壁造成损伤,继而诱发血小板黏附和附壁血栓形成。机械损伤使用柔性导丝在血管内部旋转而造成动脉内皮损伤,随即诱发附壁血栓形成。损伤的动脉中膜平滑肌细胞丢失和坏死在造模第1天同时发生。在随后的14d内,血栓形成和血小板沉积从第1天的100%逐渐衰减到25%。该模型通常使用蛋白酶受体-1缺乏的转基因小鼠,用于研究细胞增殖和中膜增厚;另一种物理损伤是由微电凝器产生穿透动脉血管壁的电流对动脉血管壁造成损伤,随后诱导由血小板和纤维蛋白形成混合血栓。既往电损伤模型使用过C57BL/6小鼠和ApoE基因敲除小鼠。

鼠后肢缺血模型的造模评价通常基于观察目标肢体血流灌注的变化。对于急性后肢缺血模型的造模评价,通常在造模后立即对目标后肢进行血管检查或血流灌注检测,并与对侧后肢(未行造模操作侧)作对比。而亚急性后肢缺血模型往往在造模后的2周内进行多次检测来评价模型动物。

激光多普勒灌注成像

激光多普勒灌注成像是基于激光和红细胞之间的相互作用引起的多普勒频移被记录并转换为电信号上进行分析的结果。该技术能够用于监测人体或动物组织血流灌注的情况。激光多普勒灌注成像作为一种非侵入性的组织血流灌注检测方法,在同种实验条件下具有较高的一致性和可重复性,是使用最为广泛的评价鼠下肢缺血模型的方法。

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鼠的性别也会对模型本身造成影响，有研究发现C57BL/6J的雌性小鼠在动脉结扎手术后7d血流灌注恢复比雄性小鼠低,这可能由雌性小鼠后肢侧枝重构减少、血管生成减少、血管舒张反应受损和血管收缩活性增加所致。并且,鼠的年龄会影响缺血恢复的速度。幼年(6~8周龄)鼠比老年(8~10月龄)鼠血流灌注恢复更快、更完整。对于促血管新生的研究,老年鼠是最佳选择,因为可能在治疗干预后观察到不同组之间更为显著的差异。而对于抗血管新生的研究,应优先选择幼年鼠来更好的呈现实验结果。

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