散斑血流成像专题⑩丨大鼠急性硬膜下血肿脑表面血流

急性硬膜下血肿（ASDH）是创伤性颅脑损伤常见的继发性损害，发病率和病死率较高。

雄性成年Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）30只，体重350~370g，随机分为两组，各15只，顶部及右侧腹股沟区备皮、消毒。以3%异氟烷气体诱导麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上，改用2%异氟烷麻醉。使用小动物生命监测仪，连接右侧股动脉置管监测血压，呼吸探头监测呼吸频率及潮气量。加热垫维持大鼠体温于37.0℃左右。

SD大鼠急性硬膜下血肿模型制作

传统方法组：根据Miller建模方法，在头皮正中作0.5cm切口，显露冠状缝和矢状缝。在手术显微镜下，在冠状缝后1.7mm，矢状缝右侧2mm钻孔，直径3mm，显露并切开硬脑膜。快速将23G的J形钝性针头放入硬膜下腔，使用医用蛋白粘合剂封闭骨孔并固定针头。使用1mL注射器从股静脉抽取非肝素化自体血0.4mL，连接J形钝性针头。使用微量注射泵以0.08mL/min的速度缓慢注射，注射完毕后暂停15分钟，待血液凝固，取出J形钝性针头，以骨蜡封闭骨孔。全程监测SD大鼠颅内压、血压等生命体征至封闭骨孔后2h，缝合顶部皮肤及腹股沟区组织，继续饲养。传统模型手术时间：注射前操作约需要25分钟，注射过程5分钟，等待血液凝固15分钟，缝合皮肤等约5分钟，共计约50分钟。

Fig1 动物模型建立示意图

改良方法组：头皮正中作0.5cm切口，显露冠状缝和矢状缝。在手术显微镜下，在冠状缝后1.5mm，矢状缝右侧3mm处钻骨孔，直径1.3mm。在手术显微镜下刺破硬脑膜，打开直径1mm的缺口。迅速将纺锤形8G小鼠灌胃针头（最大外径1.4mm，顶端最小外径1mm，内径0.8mm）嵌入骨孔使得针口紧贴硬膜缺口。使用1mL注射器抽取股静脉非肝素化自体血0.4mL，排尽多余空气，37.0℃恒温水浴静置3min，使部分血液稍有凝固，将注射器连接针头，使用微量注射泵缓慢注入硬膜下，注射持续时间5min，速度0.08mL/min。注射过程中将吸入异氟烷气体调整为1%浓度维持，防止注射过程中出现呼吸暂停现象。注射完毕后即刻取出针头，以骨蜡封闭骨孔，重新调整异氟烷为2%维持。全程监测颅内压、血压等生命体征至封闭骨孔后2h，缝合头皮及腹股沟组织，继续饲养。改良模型手术时间：注射前操作约需要27分钟，等待血液稍微凝固3分钟，注射过程5分钟，缝合皮肤等约5分钟，共计约40分钟。

颅内压监测:

在ASDH模型制作前，在冠状缝后1.5mm，矢状缝左侧1.5mm处钻一个2mm的骨孔。将颅内压探头插入脑实质，穿刺深度4mm，将传感器连接到Codman颅内压监护仪上。

动物观察:

两组模型制作完成后，行鼠脑磁共振检查，验证模型成功。6h后，每组各取3只SD大鼠制作脑组织标本。其余24只大鼠继续饲养，并分别于造模后6h、1天、2天、3天、5天、7天进行行为学评分，持续观察存活情况。7天后剩余大鼠予以安乐死。

1、磁共振检查

使用7.0T核磁共振成像仪扫描T2序列，参数设定：回波时间33ms，重复时间2500ms，平均值4，重复1，回波间隔时间11ms，罕见因素8。磁共振成像观察血肿形态分布情况。选取血肿厚度最大层面，测量血肿厚度。并使用ImageJ软件获得每张磁共振层面注射侧的血肿面积Si（mm2），间接计算大鼠注射侧的硬膜下血肿体积（mm3），V血肿体积=∑Si×1mm（i=不同层面序号）。

2、行为学评分

依据Berderson评分法评价SD大鼠脑皮层损伤情况。提起鼠尾，使其离地0.33m高，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称向前伸开，如果有肩部内旋、前肢内收现象发生者，根据其严重程度.最高评分为3分.正常评分为0分。将动物置于平滑地板上，分别推其左、右肩向对侧移动，此时检查动物抵抗推动时的阻力，正常大鼠两侧推动的阻力明显对称。如一侧阻力下降者.可根据下降程度评1-3分。正常评分为0分。观察两前肢肌力。将动物两前肢置于一金属网上.然后轻提起大鼠.检查两前肢肌力。正常左右对称.如有一侧前肢肌力下降者.根据下降程度评为1-3分。正常评分为0分。积分值为0-9分，3分以上的大鼠症状较显著。同时记录大鼠存活情况。

动物分组及模型制作

雄性成年Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）30只，体重350~370g，随机分为A、B、C三组，每组各10只，顶部及右侧腹股沟区备皮、消毒。以3%异氟烷气体诱导麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上，改用2%异氟烷麻醉。加热垫维持大鼠体温于37.0℃左右。头皮正中作1.5cm切口。在冠状缝与人字缝之间打磨一7mm×5mm骨窗，将颅骨打磨至透明，可见下方血管。

A组：本组为0.2mL组。在手术显微镜下，在冠状缝后1.5mm，矢状缝右侧3mm处钻骨孔，直径1.3mm。在手术显微镜下刺破硬脑膜，打开直径1mm的缺口。迅速将梭形8G小鼠灌胃针头嵌入骨孔使得针口紧贴硬膜缺口。使用1mL注射器抽取股静脉非肝素化自体血0.4mL，排尽多余空气，37.0℃恒温水浴静置3min，使部分血液稍有凝固，将注射器连接针头，使用微量注射泵缓慢注入硬膜下，注射量0.2mL,注射持续时间2.5min，速度0.08mL/min。注射完毕后即刻取出针头，以骨蜡封闭骨孔。

B组：本组为0.4mL组。在手术显微镜下，在冠状缝后1.5mm，矢状缝右侧3mm处钻骨孔，直径1.3mm。在手术显微镜下刺破硬脑膜，打开直径1mm的缺口。迅速将梭形8G小鼠灌胃针头嵌入骨孔使得针口紧贴硬膜缺口。使用1mL注射器抽取股静脉非肝素化自体血0.4mL，排尽多余空气，37.0℃恒温水浴静置3min，使部分血液稍有凝固，将注射器连接针头，使用微量注射泵缓慢注入硬膜下，注射量0.4mL,注射持续时间5min，速度0.08mL/min。注射完毕后即刻取出针头，以骨蜡封闭骨孔。

C组：本组为sham组。在手术显微镜下，在冠状缝后1.5mm，矢状缝右侧3mm处钻骨孔，直径1.3mm。在手术显微镜下刺破硬脑膜，打开直径1mm的缺口。迅速将梭形8G小鼠灌胃针头嵌入骨孔使得针口紧贴硬膜缺口。使用1mL注射器抽取股静脉非肝素化自体血0.4mL后丢弃，另取空的1mL注射器一支，接在灌胃针上，不做注射操作。等待5分钟后即刻取出针头，以骨蜡封闭骨孔。

激光散斑成像数据监测

使用激光散斑成像（LSCI）系统监测血流动力学变化。该系统由一台奥林巴斯ZS61显微镜、一个连续波长（λ=785nm）的激光光源、一台相机和一台计算机组成。以T=10ms的图像曝光时间，实现脑血流量（CBF）的连续动态监测。利用LSCI透过透明骨窗观测大鼠上矢状窦、皮层静脉、动脉的血流情况，分别于术前（即注射前），术后5min，30min，60min，90min，120min记录数据。

Fig2 大鼠颅骨的透明骨窗制备及LSCI监测示意图

A：a：绿色矩形区域为透明骨窗区域，大小7mm×5mm，颅骨打磨至透明可见下方血管用于观察；b：蓝色圆形区域为颅内压探头放置骨孔的区域，圆心点在冠状缝前1.5mm，矢状缝左侧1.5mm处，直径2mm；c：红色圆形区域为硬膜下血肿注射骨孔的区域，圆心点在冠状缝后1.5mm，矢状缝右侧3mm处，直径1.3mm；

B：图中黑色圆点区域即为感兴趣区域（ROI）的示意，d区域为上矢状窦的观测点，e-h区域均为侧枝静脉的观测点，i区域为动脉的观测点，以上区域均为示意，具体实验过程，由于血肿注入后会遮盖注射侧半球的血管，因此实际测量仅为注射侧对侧半球的血管，选取ROI方式如图中。

Fig3 大鼠脑表面血流激光散斑图

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