动物行为实验方法硬核总结：高架十字迷宫实验

一、实验原理

高架十字迷宫（the elevated plus maze,EPM）是评价啮齿类动物焦虑反应的实验方法 , 相较伤害性刺激所致小鼠焦虑行为检测（如电刺激 、 噪声刺激 、 饮食剥夺和暴露在捕食者气味等）, 该实验具有操作简单的优点 , 能直观反映小鼠的条件应答 。EPM实验是在高架Y型迷宫的基础上发展而来的 。EPM由开臂（open arms和闭臂（closed arms）各两条组成 , 呈十字形交叉 , 交接部分为中央区 , 距地面有一定高度 。其原理是由于面对新事物开臂 小鼠会产生好奇心去探究 , 而它们有嗜暗的天性（闭臂）, 两者之间发生探究与回避的冲突行为，产生焦虑心理。整个迷宫距离地面的高度相当于人类站在悬崖边，易导致动物产生恐惧不安的心理。可以通过对比小鼠在开臂和闭臂内的滞留时间和路程来评价小鼠的焦虑行为。

EPM实验在药物开发和研究中得到广泛的应用：主要用于苯二氮卓类药物的抗焦虑作用研究 及筛选具有抗焦虑作用的新药,也被用于研究精神性药物滥用的影响及激素的功能,应激对生殖、衰老、妊娠的影响等。抗焦虑药主要选择性地抑制边缘系统 的海马、杏仁核 ,产生抗焦虑作用。

二、实验仪器

高架十字迷宫主要由两条开臂和两条闭臂组成，互相垂直呈十字交叉，仪器上方装有动物行为实验专用的监控摄像机，通过采集卡连接电脑内的SuperMaze或VisuTrack动物行为分析软件。高架十字迷宫实验仪器区分大小鼠，尺寸不一样。

通常情况下：

1、大鼠臂宽10cm，臂长50cm，闭臂高40cm，迷宫离地高度60-70cm左右；

2、小鼠臂宽5cm，臂长35cm，闭臂高15cm，迷宫离地高度约40-55cm左右；型号：XR-XG201

高架十字迷宫，型号：XR-XG201，上海欣软

三、实验步骤

1、实验之前，一定要确保高架十字迷宫整个装置的清洁。这个步骤不仅仅是要求当天的首次实验，更加侧重于每一次动物实验完成后的清洁除味工作，一定要去除上一只动物在宫体内遗留下来的尿液、粪便等，尽可能创造一个清洁、无味道的理想试验环境。同时，实验员需要记录动物的编号、日期、状态等信息；实验动物提前运送到行为学实验室专用临时笼架 ,适应环境至少3H左右, 减少动物紧张。

2、将实验动物（大鼠或者小鼠）从饲养笼中取出，实验动物尽量背向实验员，将动物轻轻放在仪器宫体的中央区域，动物面向开臂，然后实验员迅速安静的离开；

3、打开SuperMaze或者VisuTrack动物行为分析软件，跟踪动物在高架十字迷宫仪器内的轨迹运动，自动计算指标，通常实验时长为5min；

4、实验结束后，取出实验动物，放入饲养笼，做好实验完成动物的标记信息，同时，用酒精和纸巾清洁迷宫。

四、实验指标

1、进入开放臂次数（open arm entry，OE）：进入到任一开放臂的次数，以动物的四肢均进入臂内为准或者以动物身体80%进入臂内为准。

2、开臂活动（open arm time，OT）：动物四肢全部进入或者身体80%进入开臂内的持续时间，单位：秒。

3、进入闭臂次数（closed  arm  entry，CE）:进入到任一闭臂的次数，以动物的四肢均进入臂内为准或者以动物身体80%进入臂内为准。

4、闭臂活动（closed arm time，CT）：动物四肢全部进入或者身体80%进入闭臂内的持续时间，单位：秒。

5、向下探究次数（head-dipping）：实验动物置身于中央区域或者开臂时，一边用前爪握住迷宫边缘一边把头部和肩部伸出开臂的边缘向迷宫下面探究的行为次数。

6、闭臂后腿直立次数（rearing）：也叫闭臂支撑性站立，动物在闭臂前腿抬起以后腿支持身体直立的次数。

7、中央区域活动：中央区域指的是开臂和闭臂链接交叉的区域，实验动物在这个区域内的活动路程和滞留时间。

五、实验统计原则

由① ～④分别计算 出 ：

① 进入开放臂和封闭臂的总次数 (OE + CE )：表示大鼠的运动力(1ocomotor activity) ：

② 进入开放臂次数比例 (OE％) ：即开放臂进入次数／(OE+CE )×100％ ；

③ 开放臂停留时间比例 (OT％) ，即开放臂停留时间／(OT+CT )×100％。每只大鼠测试5min。中间用湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进 行下一只大鼠的测试。

六、结论

高架十字迷宫试验 ( EPM ) 既可以建立焦虑应激的模型也是国际上公认的经典测量焦虑反应的方法。其原理是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐 惧心理, 形成动物的矛盾冲突来考察大鼠的焦虑状态。EPM 测试的项目中, 焦虑动物的 OE% 和 OT% 会明显降低, 经典抗焦虑药物则使两者升高, OE + CE 反映了动物的运动活性。本研究发现模型组大鼠的 OE% 和 OT% 显著下降, 运动活性也降低。HD反映了动物在非保护区内的探索行为, 代表动物对陌生环境的好奇探究或因恐惧而寻求逃避, 与焦虑程度有一定相关性, 本研究中空瓶应激后的大鼠 HD行为减少; RR可用来观察药物有无镇静作用及镇静强度。上述结果证实, 慢性应激后的大鼠明显处于焦虑状态, 说明慢性焦虑应激大鼠模型的制备成功, 且通过量化的标准客观反映出大鼠的焦虑程度。

七、实验注意事项

1、实验开始时, 实验者需要手持小鼠使其背对实验者放置在开臂与闭臂的接合处, 且让小 鼠面对开臂若面对闭臂, 实验结果将受很大影响, 且同一实验中所有小鼠均需要面对同一开臂 , 否则可能会产生数据偏差。

2、其他一些可能影响实验结果的事项包括小鼠的年龄、性别、营养及健康状态、小鼠对环境的适应、实验条件基本保持一致实验时间段、固定的实验者、灯光、气味等。

3、如果在实验中偶尔小鼠会从上掉落, 这时实验者需要立即将小鼠从地上抓起放回迷宫并将该事件记录下来, 最后在数据处理过程中留意此意外对结果产生的差异。

4、迷宫宫体距离地面的高度不宜过高或者过低，根据实验动物的大小确定。

5、可以选择一些白色或者黑色的吸水纸铺在迷宫底部，对于实验效率以及除味效果上面，更加合适。

6、务必提前至少3小时，将实验动物放在实验室适应，减少动物对新环境的不安情绪。

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