脑声常谈：焦虑对雌性成年斑马鱼热耐受和游泳能力影响

鱼类的热耐受能力受多种因素的影响,如饥饿、运动、个体大小及驯化温度等, 常以临界高温(The critical thermal maximum, CTmax)、临界低温(Critical thermal thermal minimum, CTmin)、致死高温(Lethal thermal maximum, LTmax)和致死低温(Lethal thermal minimum, LTmin)来评价。鱼类通过游泳运动完成觅食和逃避敌害等重要日常生命活动。鱼类的游泳运动根据对氧气的需求与否可分为有氧和无氧两种类型, 其中无氧运动与避敌、穿越激流和穿梭复杂生境能力关系密切, 而最大匀加速游泳速度(Ucat)是评价鱼类无氧运动能力的重要指标。焦虑是动物面对竞争、敌害或潜在威胁时最典型、最重要的应激反应之一。研究显示, 焦虑对动物生理和行为有双重影响, 急性应激诱导的焦虑是一种适应反应, 有积极的作用, 如提高警觉性和注意力以应对不利威胁, 但长期或严重的应激暴露导致的焦虑可能影响动物正常的生理和行为活动。

实验材料为雌性成年(4-6月龄)斑马鱼,养殖在实验室斑马鱼养殖系统(长45 cm×宽35 cm×高30 cm)中。光周期14L:10D,水温为(28±0.5)℃, 溶氧量>7 mg/L。每日09:00和17:00按约2%体重/次的喂食量分别喂食丰年虫和颗粒饲料1次, 投喂前关闭水阀和充气泵, 投喂1h后用虹吸管清除水中残余饲料和粪便, 以保持水体清洁。

分组及暴露方式：

挑选60尾体型大小相近的实验鱼[体重(0.57±0.16) g, 体长(2.89±0.16) cm]随机分为2组: 焦虑组(Anxiety group)和对照组(Control group), 每组30尾。焦虑组进行2周UCS处理建立焦虑动物模型,对照组保持原有条件饲养。期间, 焦虑组除UCS处理外, 其余饲养条件与对照组相同。在处理结束后禁食24h进行焦虑行为、热耐受能力和游泳能力测试。

实验方法：

焦虑行为评价

通过新缸潜水实验(Noveltank diving test)评价斑马鱼的焦虑行为。测定装置为矩形水缸(长29 cm×宽10 cm×高15 cm), 对实验鱼而言为陌生环境。装水至水深10 cm, 分为上下两个区域(分别高5 cm), 在水缸正前方50 cm处安置一个连接电脑的高清广角摄像头(Logitech WebcamPro9000, 1080×720 p), 将实验斑马鱼由循环养殖系统转移至行为拍摄室, 适应5min后再放入新水缸测试, 测试时长6min, 测试过程中拍摄视频记录斑马鱼的行为轨迹。利用人工观察视频分析斑马鱼6min内: (1)上下层穿梭次数(Transitions in upper half);(2)进入顶层潜伏时间(Latency to upper half); (3)顶层停留时间占比(Proportion of time in upper half);(4)冻结潜伏时间(Latency before Freezing, 冻结指实验鱼在2s或更长的时间保持不动); (5)冻结次数(Freezing bouts); (6)冻结持续时间占比(Proportion of freezing time); (7)不稳定运动次数(Erratic movements,不稳定运动指方向或速度的突然变化和快速的游泳行为), 以评价各组实验鱼的焦虑行为。

热耐受能力测定

焦虑行为测试结束后每组随机选择16尾鱼(高温耐受和低温耐受各8尾)采用临界温度法测定热耐受能力。测定装置为50 L容器, 内置4个单元格(细铁丝网围制, 长11.5 cm×宽9.5 cm×高15 cm), 每次可测定4尾鱼。装置内水温28℃, 溶氧>7 mg/L, 升温/降温前将斑马鱼分别放入单元格中适应1h。适应结束后通过冷水机(1.5 P)或可调功率加热棒(3000 W)以0.3℃/min的速率进行匀速降温或升温, 期间通过充气泵持续充气, 保证实验水体内氧含量充足。使用精密温度计监控水温变化, 以实验鱼第一次失去平衡时的温度作为CTmax或CTmin; 鳃盖停止呼吸10s并对尾部刺激无反应时的温度为LTmax或LTmin。

游泳能力测定

使用Blazka式鱼类游泳测定仪测定Ucat, 每组10尾鱼。将单尾实验鱼转入仪器中适应1h, 仪器中水流速度约为3 cm/s (约1倍实验鱼体长/s)。随后,将仪器中的水流速度以 0.167 cm /s2的恒定加速度持续增加, 直至实验鱼无法向前游泳, 并停留在仪器末端时停止实验, 此时的流速即为鱼的 Ucat值。

斑马鱼慢性不可预测应激处理方案

焦虑对动物的生存产生着双重效应。急性应激诱导的焦虑被认为是一种适应性反应, 但长期或严重的应激暴露可能会对动物的正常生理和行为活动产生不利影响。然而, 2周UCS暴露诱导的焦虑对实验鱼的低温耐受能力产生了不利影响, 说明其代表了一种长期或严重的应激压力, 提示研究者在探究长期应激导致的焦虑对鱼类生理和行为的影响时可以参考该模型。在自然界中, 游泳与鱼类的觅食、避敌及栖息地选择等日常生命活动息息相关, 因此游泳能力成为反映鱼类生存适合度的重要指标。长期应激导致的焦虑可能会造成鱼类能量代谢增加, 体质以及免疫力下降, 进而对游泳能力产生消极影响。

最大匀加速游泳速度(Ucat)比较

阅读原文