散斑血流成像专题⑤丨应用场景之小鼠大脑中动脉栓塞

简介

监测大脑中动脉闭塞MCAO模型血流动力学的设备主要有普通光学和电子显微镜、数字减影血管造影（Digital Subtraction Angiography，DSA）等。光学和电子显微镜无法定量检测血流速度、血管密度等血流动力学参数，正电子发射断层成像、功能核磁共振成像、数字减影血管造影等设备昂贵，不易操作及观察动物模型，由于较低空间分辨率和时间分辨率，同样不能实时监测微循环血流动力学改变。激光散斑成像技术（Laser Speckle Imaging，LSI）具有无创、非接触性、无电离辐射、长时程、高时空分辨率等优点，同CCDI（Charge-Doupled Device）相机及运算设备连接运行时，图像采集过程中激光均匀照射在缺血区域，原始图像通过激光散斑成像系统进行血流运算处理转换为流速信息，可以采集到兼顾微米量级的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率的皮层流速图像参数。可以满足大范围实时监测脑皮层血流动力学参数，评估缺血区的坏死状况，经过激光散斑成像系统处理原始图片，流速快颜色偏红，流速慢则颜色偏蓝，更加直观了解皮层血流速度，以及大概判断制作模型是否成功。

应用

激光散斑成像能实时监测脑血流变化，获得大范围硬脑膜及皮层区域的血流动力学包括血流速度、血管直径、血流灌注、氧化代谢率等皮层微循环参数，大脑皮层功能区的活跃程度与血供有关，从血流动力学的角度阐述缺血性脑卒中的发病过程，以及侧枝循环开放及脑血流重新分布代偿情况，激光散斑成像通过皮层微循环评估梗死区的缺血坏死状况，可以用于研究脑功能区的神经活动，协助预测再通后出血转化及脑水肿的程度，对再通的临床诊疗及个体化的临床治疗具有很大助益。激光散斑成像广泛应用于生命科学、工业测量等领域，用于测量血流、粗糙程度、形变等，临床上用于皮肤科疾病、肿瘤、眼底视网膜血管病变等诊疗中具有重要价值。

实验步骤

将32只小鼠随机分为假手术对照组8只、pMCAO再灌注3天组8只、pMCAO再灌注7天组8只、pMCAO再灌注14天组8只。采用线栓法制备大脑中动脉闭塞MCAO模型，所有小鼠均在造模术前，术后（包括再灌注取线栓术后）及术后第3、7、14天使用激光散斑成像系统采集左侧缺血区域（行左侧大脑中动脉栓塞）白光图像及皮层血流数据。四组小鼠术前需适应实验室环境，在手术前均需禁食禁水，避免麻醉过程中出现误吸发生呼吸困难。使用高速牙科磨钻在前囟和后囟之间的顶骨区域磨制透明骨窗，对照组进行手术操作，但把线栓插入到大脑中动脉开口处即撤回，栓塞术后进行评估小鼠神经功能，再灌注3天组在栓塞第三天取出线栓，以此类推。按照时间点采集散斑图像，取出线栓后记录术后半小时的皮层血流数据。

Fig1 激光散斑血流术前基线图

制作小鼠MCAO模型并采集数据连接动物吸入麻醉机，打开氧气阀门，调整氧分压至1左右，再打开异氟烷阀门，调整异氟烷值为3，氧气流量为300ml／min，约2-3分钟待小鼠停止自主活动后提示小鼠麻醉成功，手术操作均在实验动物安全柜中进行，将呼吸面罩连接动物吸入麻醉机气体管道，垫上反馈式加热装置，维持小鼠体温为（37±0.5）°Ｃ左右，调整动物吸入麻醉机异氟烷值为1.5，观察小鼠麻醉状态，可调整异氟烷流量大小直至小鼠麻醉状态稳定。小鼠诱导麻醉后置于仰卧位，将小鼠门齿利用缝合线钩住固定，使小鼠颈部拉伸，同时用医用胶带固定小鼠四肢，用电推剪剪去颈胸前外侧区域的毛发，需要足够大的范围保证后面手术操作相对无菌，清理干净细碎毛发，碘伏消毒。显微镜下沿颈部前正中线，利用眼科剪剪开约1cm的切口，用显微镊小心钝性分离颈部腺体组织、筋膜，掀开甲状腺右叶，牵开肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌见到颈动脉三角，暴露颈内动脉和颈外动脉，外上界为二腹肌后腹，外下界是胸锁乳突肌，使用小拉勾将胸锁乳突肌向外牵拉，显微镜下使用显微镊分离右侧颈总动脉约3mm至分叉处并穿线备用，由于显微血管夹挡住手术视野，这里采用的是6－Oprolene单丝缝线代替显微血管夹，同时小心游离颈内动脉和颈外动脉，注意避免牵拉损伤伴行的迷走神经，游离出甲状腺上动脉予以电凝，这里注意使用电凝笔避开组织及血管，小鼠MCAO模型可不结扎枕动脉和翼腭动脉，翼腭动脉未阻断对脑血流影响不大，本实验选择结扎翼腭动脉，避免线栓插入翼腭动脉可能，保证颈内动脉为颈总动脉的唯一分支。仔细解剖颈外动脉，单丝缝线在其远心端予以永久结扎，近心端预留临时结扎，切断颈外动脉造成残端，这样可以获得一段血管，需要注意的是，预留足够长的血管，一般约3mm的颈外动脉残端才能满足最后的结扎固定。使用显微镊以活结方式将丝线结扎颈总动脉及颈总动脉分叉下方的颈内动脉阻断血流，将颈外动脉残端向下拉，在颈外动脉断端用显微剪剪开适当大小的垂直于血管直径的切口，插入带有硅涂层头端的线栓并用预留丝线固定在颈外动脉上，线栓预先用碘伏浸泡消毒，固定松紧度以能够继续推动线栓为标准，使用显微镊子打开颈内动脉的活结丝线，将线栓缓慢沿颈外动脉插入颈内动脉，注意缓慢推进线栓的过程中避免线栓进入枕动脉和翼腭动脉，当插入深度约10mm左右时，此时使用显微镊再推进线栓时会有轻微阻力感，提示线栓头端此时到达大脑中动脉起始部。小鼠的MCAO模型均是采用线栓栓塞大脑中动脉起始部即可阻断大脑中动脉的血流，同时避免损伤血管甚至可能造成线栓插入脑组织使模型失败。再次固定线栓，剪去多余线栓尾部，缝合颈部手术切口，注意术后保持小鼠直肠温度为37土0．5°Ｃ，待动物苏醒后单独置于饲养笼中。

神经功能评分:

制备大脑中动脉栓塞MCAO模型手术后24小时对小鼠进行神经功能评分，采用ZeaLonga神经功能五分制评分，即0分：无神经功能缺失，1分：轻度局灶性神经功能缺损（不能完全伸展右前爪），2分：中度局灶性神经功缺损（向右旋转），3分：重度局灶性神经功能缺失（向右下降），4分：不能行走，意识水平低下。

Fig2 左侧大脑中动脉栓塞激光散斑血流流速图

对照组接受所有手术操作，相同的打开颈外动脉插入线栓，到达大脑中动脉起始部则取出线栓，即不放置线栓，然后使用6-0缝线结扎颈外动脉，恢复颈内动脉和颈总动脉的血流，在术前、术后、术后3、7、14天使用激光散斑成像系统采集血流数据。

pMCAO晚期开通

再灌注动物在pMCAO后3、7、14天从大脑中动脉拆线。在拆线当天，用异氟烷麻醉小鼠通过磨薄骨窗行激光散斑成像系统采集血流数据。然后将动物仰卧，维持麻醉状态，碘伏消毒，重新打开颈部切口。显微镜下分离颈外、颈总和颈内动脉并穿线备用，暴露从颈外动脉残端突出的线栓尾部。将线栓从大脑中动脉轻轻拉回，直到硅胶头端靠近颈外动脉残端。使用6-0缝线临时活结结扎阻断颈内动脉和颈总动脉血流。将线栓完全从动脉中取出，使用缝线结扎颈外动脉，去除颈内动脉和颈总动脉的活结，缝合颈部伤口，术后半小时俯卧位再次行激光散斑监测。

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