散斑血流成像专题⑥丨应用场景之脑皮层扩散性抑制

问题探究：脑皮层扩散性抑制(CSD)对蛛网膜下腔出血(SAH)模型小鼠脑皮层微循环的影响。

材料与方法：

将30只雄性C57小鼠（体重20~25g）随机分为正常组、对照组、观察组，每组10只。三组分别制作透明颅窗，正常组诱导窗滴KCl；对照组制作SAH模型、诱导窗滴NaCl；观察组制作SAH模型、诱导窗滴KCl。观察小鼠建模后1、3、5、7、14dCSD情况，同时观察脑皮层微循环变化。

SAH模型的建立：

采用颈动脉内穿刺法构建SAH模型。小鼠通过1:3的氧气与异氟烷进行麻醉后，固定于手术台。作颈部正中切口，体视学显微镜下逐层分离皮下组织，暴露颈总动脉（common carot⁃id artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。活结结扎ICA、CCA，牢固结扎ECA。从ECA结扎近心端将一根5-0穿刺线经ECA插入ICA，在穿刺入口近心端结扎，从ECA两个结扎端离断ECA。旋转穿刺线，使穿刺方向由ICA至CCA，随后将穿刺线往前推送至有轻微阻力感（约20mm），接着前进1~2mm，直到刺破大脑中动脉和大脑前动脉分叉处，迅速将尼龙线拔出。

小鼠透明颅窗及CSD诱导窗的制作：

小鼠眼球涂抹红霉素，俯卧位固定在脑立体定向仪上，通过一个反馈式的加热垫维持体温在（37±0.5）℃。作顶部正中矢状线切口，逐层暴露颅骨。在顶骨（避开冠状缝、失状缝）选取一个大小约为3mm×3mm的区域，用牙科钻将此区域磨薄至均匀透明状（用水湿润后皮层血管清晰可见），磨薄后的颅骨厚度约为100μm。在同一侧额骨，用用牙科钻钻孔（孔径1mm×1mm，为诱导CSD窗口），保持硬脑膜完整。使用玻片覆盖，周围使用骨水泥填塞进行窗的保护。

诱导CSD的方法：

采用KCl诱导，用显微注射器抽取1mol/L（双蒸水配置，高温高压灭菌）的KCl溶液1μl从诱导窗中注入皮层，深度约2mm。对照组诱导窗内加入1μl生理盐水。散斑图像和内源图像有动态变化，则成功诱导CSD后；没有动态变化，则未诱导成功。

激光散斑血流成像和内源信号成像：

模型制作后第1天对小鼠诱导前后10min内的变化进行成像，记录实验图像，并分析相关数据。散斑成像：将小鼠连同脑立体定向仪摆放在激光散斑成像处，使半导体激光器光源发出激光经过透镜组扩束整形后的均匀光斑以一定的倾斜角照射在慢性观察窗表面，记录实时图像600s。内源信号成像：将相机接头连接至内源成像孔，调节仪器、参数，记录实时图像600s。在图像记录的过程中，从诱导窗加入1μlKCl，继续观察记录图像。以后分别于模型建成后第3、5、7、14d各重复以上实验一次。成像过程中利用散斑软件计算同一处皮层微动脉血管管径及同一区域局部脑血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）。采用MATLAB软件进行分析。

观察组、对照组小鼠均可以观察到蛛网膜下腔内存在血液，可以证实颈内动脉穿刺法制造模型成功，正常组未见蛛网膜下腔出血。

1、内源信号成像下CSD波形图：  

在内源下观测CSD发生的过程，形成的图像利用MEATLAB加以分析，得出正常组1、3、5、7、14d所诱导的CSD波形图。波形基本变化表现为上升、下降、上升，最后波幅远高于基线以上的过程，与波长在600nm以下内源光下第一波CSD的特征基本一致。观察组在1、3、5、7、14d所诱导的CSD波形图，基本变化大致表现为上升、下降、上升的三相变化，但最后的波幅在基线以下或是略微高于基线，类似于第一波但不完全相似；有的也表现为下降、上升、下降、上升的四相变化，最后波幅明显低于基线，类似于第二次CSD过程。与正常组相比，观察组图形的改变能反映：小鼠SAH后可能存在CSD，以至于诱导不出第一波CSD波形，诱导的波形是类似于第二波CSD以及第二波以后的CSD。对照组用NaCl诱导未产生CSD，波形图表现为一条直线，皮层没有电位变化。

2、散斑下脑皮层血流图：  

激光散斑图颜色越红代表该处血流速度越快，越蓝代表该处血流速度越慢，再结合血管管径从而得出该处脑血流量。各组血管管径、rCBF的变化  对照组小鼠诱导前后血管管径变化不明显；正常组小鼠诱导CSD后血管管径较前明显增大；观察组小鼠诱导CSD后血管管径较前出现收缩。

应用激光散斑成像技术监测SAH前后及不同病程中的脑皮层微循环改变，并且同时采用内源信号光学成像实时追踪CSD的动态变化过程，发现SAH后明显出现自发性CSD，持续14d；而且，CSD会导致SAH后脑皮层血流下降、血管收缩；而正常生理情况下，CSD会使脑血流量增加，SAH后CSD引起脑血流量减少。

Fig1 激光散斑血流成像观测一次CSD过程中不同时相皮层血流图
A.诱导前（0~1min）；B.诱导后血管短暂舒张期（1.5~2min）；C.CSD血管强烈收缩期（2~4min）；D.CSD血管收缩恢复期（4~15min）；E.恢复到诱导前；红色、绿色、蓝色点数值表示该处血液流速值

文献引用：

1.Filament perforation model for mouse subarachnoid hemorrhage: Surgical-technical considerations[J]. Carl Muroi;;Masayuki Fujioka;;Kazuo Okuchi;;Javier Fandino;;Emanuela Keller;;Yuya Sakamoto;;Kenichi Mishima;;Katsunori Iwasaki;;Michihiro Fujiwara.British Journal of Neurosurgery,2014(6)

2.The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J]. Fatima A. Sehba;;Jack Hou;;Ryszard M. Pluta;;John H. Zhang.Progress in Neurobiology,2012(1)

3.佘德源,唐跃,黄钦,等.脑皮层扩散性抑制对大鼠蛛网膜下腔出血后皮层微循环的影响[J].中国临床神经外科杂志,2019,24(06):352-355.

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