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日本科学家发现关键蛋白质,对非应激条件下的雄性生殖至关重要
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2024年4月29日,日本熊本大学Kei-ichiro Ishiguro团队在Nature communications发表“Atypical heat shock transcription factor HSF5 is critical for male meiotic prophase under non-stress conditions”,揭示了非典型热休克转录因子HSF5在非应激条件下对雄性减数分裂前期至关重要。
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减数分裂前期的进展在雄性和雌性中受到不同的调控。在雄性中,减数分裂前期的粗线转变伴随着基因表达的改变。然而,基因表达如何不同的调控,以确保减数分裂前期完成仍然知之甚少。在此,作者鉴定了HSF5作为一个雄性生殖细胞特异性热休克转录因子(HSF)的减数分裂前期进展中的作用。基因分析和单细胞RNA测序表明,在非应激条件下,而不是热应激条件下,HSF5对超过粗线期阶段的进展至关重要。体内染色质结合分析和体外DNA结合分析表明,HSF5与染色质组织相关的一个基因子集中的启动子结合。HSF5识别的DNA基序不同于其他典型HSF识别的典型热休克元件。本研究提示HSF5是一种非典型HSF,是雄性减数分裂前期粗线质转化的基因表达程序所必需的。
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图一 HSF5在小鼠睾丸的减数分裂前期表达
HSF5基因被鉴定为meiosin/stra8靶基因之一。然而,除了HSF5在雄性MSCI的建立中可能需要外,其在小鼠中的生物学功能尚未完全阐明。在小鼠基因组中鉴定出6个编码HSFs的同源基因。HSF家族具有一个DNA结合域,并在热应激反应(HSR)和非应激条件下作为一个转录因子。HSF1、HSF2和HSF4具有两个七肽重复序列HR-A和HR-B,它们被预测形成分子间亮氨酸拉链用于同源三聚体寡聚,而HSF5缺乏这些七肽重复序列。HSF5在25°C下以单体和二聚体/三聚体的混合物存在,但在较高的温度下形成高阶低聚物。HSF5的这种热响应类似于HSF1,它在热休克下形成高阶低聚物。相比之下,含有DNA结合域(HSF5-DBD)的HSF5片段在25°C和42°C上均处于单体状态,表明HSF5的寡聚化是由DBD以外的另一个区域介导的。
因此,HSF5在体外具有进行寡聚的结构特征。作者使用RT-PCR检测了不同小鼠组织中HSF5的稳态mRNA水平。HSF5 mRNA在幼年小鼠和成年小鼠睾丸中特异性检测到,但在检测的其他成年器官中没有检测到。RT-PCR显示,HSF3在睾丸和卵巢中被检测到。通过重新分析来自成年小鼠睾丸的scRNA-seq数据,来评估HSF5和其他HSF成员的生精mRNA水平。scRNA-seq数据的统一流形近似和投影(UMAP)显示,HSF5 mRNA水平在减数分裂前期增加,与小鼠生精细胞中其他HSF成员不同。与生精表达相比,RT-qPCR在胚胎第12.5天(E12.5)-E18.5天的胎儿卵巢中几乎没有检测到HSF5的表达,提示HSF5在胎儿卵巢中表达水平较低。这些观察结果表明,HSF家族的同源基因在睾丸的不同阶段发挥作用,并且HSF5在精子发生过程中发挥着减数分裂特异性的作用。
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图二 HSF5基因敲除的雄性精子发生受损
为了阐明HSF5在小鼠中的作用,作者使用CRISPR/Cas9系统敲除C57BL/6受精卵中HSF5位点的所有编码外显子。HSF5敲除(KO)睾丸提取物的免疫印迹显示HSF5蛋白缺失,表明靶向HSF5等位基因被敲除。虽然HSF5 KO雄性小鼠在体细胞组织中没有表现出明显的表型,在幼年(4周龄)和成年(8周龄)小鼠相比,HSF5 KO小鼠的睾丸更小。组织学分析显示,与WT和HSF5 +/-小鼠相比,4周龄HSF5+KO小鼠减数分裂后精子缺失。因此,在第8周时,成年HSF5 KO尾侧附睾中没有精子。HSF5 KO小鼠中不存在含有PNA凝集素(精子的标记物)的精管阳性细胞。因此,精子发生的后期阶段是在HSF5 KO精管中完成的。与雄性相比,HSF5 KO的雌性表现出正常的生育能力,而在成年卵巢中没有明显的缺陷。这些结果表明,HSF5在精子发生中是必需的。
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图三 HSF5对于睾丸中的HSR是不可或缺的
为了评估HSF5是否参与了HSR,作者在33和37°C时比较了HSF5 +/-和HSF5 KO睾丸的基因表达变化。将HSF5 +/-和HSF5 KO小鼠的全睾丸在33或37°C下孵育3h,用RNA-seq检测其转录组。主成分分析(PCA)表明,HSF5 +/-和HSF5 KO睾丸在在37°C与33°C时沿PC3表现出相同的差异基因表达趋势。此外,在HSF5 +/-和HSF5 KO中分别鉴定出39个和417个基因为差异表达基因(DEGs)。在HSF5 +/-和HSF5 KO中普遍发现了33个DEGs,包括HSR基因Hspa1a和Hspa1b。这些数据表明,HSF5对于睾丸的热应激反应是不可或缺的。
染色质结合分析结合转录组分析显示,HSF5作为一种非典型的HSF,因为它的靶点特异性和对发育调控的需求,而不是主要与热应激反应相关。
文章来源:
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47601-0
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