日本科学家发现关键蛋白质，对非应激条件下的雄性生殖至关重要

2024年4月29日，日本熊本大学Kei-ichiro Ishiguro团队在Nature communications发表“Atypical heat shock transcription factor HSF5 is critical for male meiotic prophase under non-stress conditions”，揭示了非典型热休克转录因子HSF5在非应激条件下对雄性减数分裂前期至关重要。

减数分裂前期的进展在雄性和雌性中受到不同的调控。在雄性中，减数分裂前期的粗线转变伴随着基因表达的改变。然而，基因表达如何不同的调控，以确保减数分裂前期完成仍然知之甚少。在此，作者鉴定了HSF5作为一个雄性生殖细胞特异性热休克转录因子（HSF）的减数分裂前期进展中的作用。基因分析和单细胞RNA测序表明，在非应激条件下，而不是热应激条件下，HSF5对超过粗线期阶段的进展至关重要。体内染色质结合分析和体外DNA结合分析表明，HSF5与染色质组织相关的一个基因子集中的启动子结合。HSF5识别的DNA基序不同于其他典型HSF识别的典型热休克元件。本研究提示HSF5是一种非典型HSF，是雄性减数分裂前期粗线质转化的基因表达程序所必需的。

图一 HSF5在小鼠睾丸的减数分裂前期表达

HSF5基因被鉴定为meiosin/stra8靶基因之一。然而，除了HSF5在雄性MSCI的建立中可能需要外，其在小鼠中的生物学功能尚未完全阐明。在小鼠基因组中鉴定出6个编码HSFs的同源基因。HSF家族具有一个DNA结合域，并在热应激反应（HSR）和非应激条件下作为一个转录因子。HSF1、HSF2和HSF4具有两个七肽重复序列HR-A和HR-B，它们被预测形成分子间亮氨酸拉链用于同源三聚体寡聚，而HSF5缺乏这些七肽重复序列。HSF5在25°C下以单体和二聚体/三聚体的混合物存在，但在较高的温度下形成高阶低聚物。HSF5的这种热响应类似于HSF1，它在热休克下形成高阶低聚物。相比之下，含有DNA结合域（HSF5-DBD）的HSF5片段在25°C和42°C上均处于单体状态，表明HSF5的寡聚化是由DBD以外的另一个区域介导的。

因此，HSF5在体外具有进行寡聚的结构特征。作者使用RT-PCR检测了不同小鼠组织中HSF5的稳态mRNA水平。HSF5 mRNA在幼年小鼠和成年小鼠睾丸中特异性检测到，但在检测的其他成年器官中没有检测到。RT-PCR显示，HSF3在睾丸和卵巢中被检测到。通过重新分析来自成年小鼠睾丸的scRNA-seq数据，来评估HSF5和其他HSF成员的生精mRNA水平。scRNA-seq数据的统一流形近似和投影（UMAP）显示，HSF5 mRNA水平在减数分裂前期增加，与小鼠生精细胞中其他HSF成员不同。与生精表达相比，RT-qPCR在胚胎第12.5天（E12.5）-E18.5天的胎儿卵巢中几乎没有检测到HSF5的表达，提示HSF5在胎儿卵巢中表达水平较低。这些观察结果表明，HSF家族的同源基因在睾丸的不同阶段发挥作用，并且HSF5在精子发生过程中发挥着减数分裂特异性的作用。

图二 HSF5基因敲除的雄性精子发生受损

为了阐明HSF5在小鼠中的作用，作者使用CRISPR/Cas9系统敲除C57BL/6受精卵中HSF5位点的所有编码外显子。HSF5敲除（KO）睾丸提取物的免疫印迹显示HSF5蛋白缺失，表明靶向HSF5等位基因被敲除。虽然HSF5 KO雄性小鼠在体细胞组织中没有表现出明显的表型，在幼年（4周龄）和成年（8周龄）小鼠相比，HSF5 KO小鼠的睾丸更小。组织学分析显示，与WT和HSF5 +/-小鼠相比，4周龄HSF5+KO小鼠减数分裂后精子缺失。因此，在第8周时，成年HSF5 KO尾侧附睾中没有精子。HSF5 KO小鼠中不存在含有PNA凝集素(精子的标记物)的精管阳性细胞。因此，精子发生的后期阶段是在HSF5 KO精管中完成的。与雄性相比，HSF5 KO的雌性表现出正常的生育能力，而在成年卵巢中没有明显的缺陷。这些结果表明，HSF5在精子发生中是必需的。

图三 HSF5对于睾丸中的HSR是不可或缺的

为了评估HSF5是否参与了HSR，作者在33和37°C时比较了HSF5 +/-和HSF5 KO睾丸的基因表达变化。将HSF5 +/-和HSF5 KO小鼠的全睾丸在33或37°C下孵育3h，用RNA-seq检测其转录组。主成分分析（PCA）表明，HSF5 +/-和HSF5 KO睾丸在在37°C与33°C时沿PC3表现出相同的差异基因表达趋势。此外，在HSF5 +/-和HSF5 KO中分别鉴定出39个和417个基因为差异表达基因（DEGs）。在HSF5 +/-和HSF5 KO中普遍发现了33个DEGs，包括HSR基因Hspa1a和Hspa1b。这些数据表明，HSF5对于睾丸的热应激反应是不可或缺的。

染色质结合分析结合转录组分析显示，HSF5作为一种非典型的HSF，因为它的靶点特异性和对发育调控的需求，而不是主要与热应激反应相关。

文章来源：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-47601-0