李洪军/顾臻/何恺鑫团队利用冷冻休克肿瘤细胞递送CRISPR-Cas9，靶向治疗肺癌

原创 生物世界

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

肺癌是全世界发病率最高的癌症之一，也是全世界癌症死亡的主要原因，每年导致约180万人死亡。其中，非小细胞肺癌（NSCLC）约占癌症总数的80%-85%。不幸的是，对于大多数晚期或转移性NSCLC患者，以及那些没有特定治疗靶点的患者，尽管现在已经整合了各种治疗方法，但中位总生存率仍然很低。

作为一种新型基因编辑工具，CRISPR-Cas9具有诊断和治疗各种肿瘤、病毒感染和遗传性疾病的潜力。与传统疗法不同，CRISPR-Cas9具有独特优势，可以永久性破坏对肿瘤生存至关重要的基因，从而实现一次治愈，无需重复给药。

然而，CRISPR-Cas9在临床应用中仍存在一些挑战，例如，其在血液中的降解或变性以及递送效率低的等问题，此外，目前主要的CRISPR-Cas9递送载体，无论是病毒载体还是非病毒载体，都缺乏组织靶向性和细胞选择性，这为CRISPR疗法的体内应用带来了一个关键障碍。

2024年3月29日，浙江大学药学院李洪军、顾臻、何恺鑫等人在 Science Advances 期刊发表了题为：Cryo-shocked tumor cells deliver CRISPR-Cas9 for lung cancer regression by synthetic lethality 的研究论文。

该研究开发了一种高效地向肺部递送CRISPR-Cas9基因编辑系统的细胞递送载体。

该研究对肺癌细胞进行快速液氮处理，消除了癌细胞的致病性而又保留了其细胞结构和表面受体的活性，将这些“冷冻休克”的肺癌细胞作为递送载体，通过被动靶向和主动靶向向肺部细胞高效递送了CRISPR-Cas9系统，有效降低了细胞周期蛋白依赖性激酶4基因（CDK4）表达水平，在KRAS突变型非小细胞肺癌（NSCLC）中引发合成致死，进而消除了肿瘤，并延长了小鼠模型的生存时间。

该研究开发了被动和主动双靶向的肺靶向CRISPR-Cas9药物递送策略，通过敲低肿瘤中的细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）来诱导非小细胞肺癌（NSCLC）的癌细胞合成致死。

合成致死（Synthetic lethality）被定义为同时失活两个基因导致细胞死亡，而其中单个基因功能丧失对细胞存活的影响很小。通常情况下，肿瘤细胞携带癌基因突变，这使它们更依赖于某些特定基因来维持细胞稳态。理论上，这些携带特定基因突变的肿瘤细胞可以通过药物抑制另一基因的合成致死相互作用而被选择性杀死，而正常细胞由于缺乏特定的基因突变而免受该药物的影响。

因此，合成致死提供了一种有前途的治疗策略，可以靶向一些不可成药的癌基因，同时减轻对正常组织和细胞的损伤。目前已有一些合成致死相互作用应用于临床试验和治疗。KRAS是许多类型癌症中最常见的突变基因之一，包括NSCLC，最近的一些研究在KRAS突变型NSCLC中发现了多种合成致死性相互作用，为增强NSCLC的临床治疗效果提供了一种替代方法。

A549细胞是一种典型的KRAS突变型NSCLC细胞，在经过液氮处理快速冷冻灭活并消除致病性后，A549细胞被用作体内CRISPR-Cas9递送载体。由于其完整的细胞结构和保留的细胞表面糖蛋白CD44，这种细胞载体可以通过肺毛细血管被动捕获以及CD44介导的细胞相互作用和粘附实现向肺部细胞的主动靶向递送。

研究团队将靶向敲除CDK4的pCas9/gCDK4质粒与脂质体转染试剂共组装形成纳米配方，并通过静电相互作用锚定到液氮处理的A549细胞表面。然后通过尾静脉注射给NSCLC荷瘤小鼠模型，与直接系统注射CRISPR-Cas9纳米颗粒相比，该新型递送载体的递送效率增加了近4倍，肿瘤内CDK4表达水平显著下降，且不影响正常细胞。CDK4敲低后在KRAS突变型NSCLC中引发合成致死，并延长了小鼠模型的生存期。

该技术的另一个优点是，可以重复利用从手术切除、穿刺活检或其他方式获取的肿瘤组织的细胞，可以被冷冻并用作基因编辑工具的递送载体以治疗癌症。此外，快速液氮处理的肿瘤细胞保留了细胞表面的肿瘤抗原，因此它们除了作为递送载体外，还可能作为肿瘤免疫治疗的疫苗。

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2020年12月，顾臻团队在 Science Advances 期刊发表了题为：Cryo-shocked cancer cells for targeted drug delivery and vaccination 的研究论文【2】。

该研究首次提出使用液氮冷冻处理来获取“治疗性死细胞”，通过这种方式获得的急性髓细胞白血病（AML）细胞失去了增殖和致病性，但仍保留了癌细胞的结构、表面抗原等，利用其递送化疗药物阿霉素（DOX），这些细胞本身还可作为肿瘤疫苗并促进抗肿瘤免疫反应，从而延长肿瘤小鼠模型的生存时间。

2024年3月，浙江大学药学院顾臻教授、李洪军研究员、浙江大学医学院附属第一医院赵鹏主任医师等在 Nature Materials 期刊发表了题为：Lyophilized lymph nodes for improved delivery of chimeric antigen receptor T cells 的研究论文【3】。

该研究在国际上首次提出了用冷冻干燥技术冻干的淋巴结来装载CAR-T细胞的新策略，提高对实体瘤的递送，并抑制手术后的肿瘤复发。这种组织介导细胞释放的组织递药策略，有望实现多种细胞和治疗药物的受控释放，具有长期活性和增强功能。

论文链接：

1. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk8264

2. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abc3013

3. https://www.nature.com/articles/s41563-024-01825-z

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