Life Med | 杜亚楠课题组报道肝硬化组织中谷氨酰胺转移酶交联的胞外基质提供促纤维化力学微环境

肝纤维化发展而来的肝硬化已成为全球排名第十三和我国排名第十的致死性疾病，且缺乏有效临床治疗手段。硬化肝组织的典型特征是形成以胶原蛋白瘢痕为主的高度交联的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM），其交联程度的增加与其抵抗蛋白酶水解、纤维化逆转困难有着密切关系。高度交联的瘢痕不仅会直接损伤肝组织结构，还会衍生出异常生物力学信号去调节细胞向促纤维化表型分化，从而促进纤维化疾病进展。胶原瘢痕的形成涉及多种交联反应，其中报道最广泛的是赖氨酰氧化酶（Lysyl Oxidase，LOX）介导的胶原交联反应，但LOX靶向治疗在临床试验中均未取得理想治疗效果，意味着需要进一步探究交联的胶原瘢痕在肝硬化中的作用。除了LOX外，谷氨酰胺转移酶（Transglutaminase，TGM）介导的交联也被许多研究报道参与纤维化肝组织中的ECM交联。TGM促相邻胶原原纤维之间形成γ-Glutamyl-ε-Lysine交联键，从而增加胶原瘢痕的稳定性、不可逆性和抗重塑性。然而，目前还没有上市的抗TGM药物用于肝硬化治疗。虽然已有许多研究报道了TGM在纤维化肝组织中异常上调，但TGM如何导致交联胶原瘢痕的异常特性，以及TGM交联如何通过调节肝组织的机械微环境来促进纤维化进程仍不清楚。因此，对肝硬化组织中TGM交联ECM进行深入表征和重建是非常必要的，并且有望探究纤维化疾病进程中相关细胞的下游调控机制。

近日，清华大学医学院杜亚楠课题组在Life Medicine上以Letter形式发表了题为“Transglutaminase-crosslinked extracellular matrix in cirrhotic liver tissues provides profibrotic mechano-microenvironment for cells”的文章。该文章主要研究了肝硬化组织中的细胞外基质的TGM交联特性及其对细胞的影响。研究发现，在肝硬化组织中，TGM及其交联产物γ-Glutamyl-ε-Lysine的表达显著增加，并且与胶原瘢痕共定位。通过体内定量和体外重建TGM交联的胶原基质模型，揭示了TGM交联可显著改变胶原纤维的结构和力学特性，导致异常的生物物理微环境，调控肝窦内皮细胞和巨噬细胞的表型和功能。这些结果揭示了TGM交联在肝纤维化疾病中的潜在机制，并通过重建基于ECM的疾病模型为机制研究和临床应用提供了新的见解。

为了精准探究ECM的交联特征，避免肝组织内细胞组分及代谢产物对交联度定量分析的影响，团队通过利用课题组此前报道的针对细胞外基质交联度的绝对定量方法（Absolute Quantification of Matrix-specific Crosslinking, AQMC），有效分离出了健康及硬化肝组织的细胞外基质，并结合液相色谱-质谱联用的方案证明高度TGM交联的肝脏ECM是肝硬化的重要病理特征，并且在临床肝硬化组织样本及肝纤维化动物模型中证明了该结论。

为了揭示TGM交联作用对ECM的影响，研究团队首次在体外构建了具有与体内ECM交联度相似的TGM交联胶原基质，从力学粘弹性、结构参数、交联度等方面重现了体内肝纤维化发展过程中ECM的病理特征。借助透射电镜和光镊技术，首次从单根胶原纤维的维度阐释了TGM交联反应对胶原基质的影响，发现TGM交联会导致相邻纤维之间相互缠绕、集结成束、形成粗大的纤维束结构，导致其刚度增大，应力松弛速率降低，从而导致TGM交联的胶原纤维更难被胶原酶降解。

接下来，研究团队利用TGM交联的体外仿生病理基质模型，探究了TGM交联的胶原基质对肝窦内皮细胞(LSECs)和巨噬细胞的调控作用。体外实验表明，TGM交联基质中异常的机械微环境导致LSECs细胞-细胞粘附异常下调，细胞-ECM粘附异常上调。这些力学信号导致YAP表达增加和纤维化相关基因表达上调。TGM交联基质也引发了原代LSECs出现开窗结构的病理性丧失。生理性窗孔结构的丧失和间隙结构的形成通常与LSECs对肝损伤和慢性疾病的细胞反应有关。这些结果表明，TGM交联的基质促进了LSECs的异常表型，并可能有助于纤维化肝组织中形成漏出的血窦。

研究结果还进一步揭示了巨噬细胞与TGM交联基质的细胞-ECM相互作用升高，且在TGM交联基质上生长的巨噬细胞比在未交联基质上生长的巨噬细胞显示出更高水平的ECM粘附分子和YAP表达的上调。巨噬细胞中YAP表达异常也可能是由于基质应力松弛减少引起的，并与疾病进展过程中免疫反应失调有关。同时，在TGM交联的基质中，巨噬细胞介导的胶原降解明显减少。

综上所述，本文在人和小鼠肝硬化组织中验证了ECM的高水平TGM交联特性，并在体外成功重建了TGM交联的胶原基质，再现了纤维化肝ECM的TGM交联程度。TGM交联通过增加基质刚度和降低应力松弛率，显著增强了基质力学性能，构成了导致细胞异常行为的力学微环境。体外实验表明，生长在TGM交联基质上的LSECs和巨噬细胞显示出促进的细胞-ECM相互作用，YAP表达和纤维化相关表型。以上研究结果揭示了TGM交联在肝纤维化疾病中的潜在机制，为纤维化疾病致病机理研究和临床应用提供了新的思路。

清华大学医学院生物医学工程系教授、清华-北大生命科学联合中心研究员杜亚楠为该文章的通讯作者，清华大学医学院生物医学工程系博士吕丞、医学院博士生孔文瑜为共同第一作者，医学院博士生张岩、刘志强、梁恺倪对本研究有重要贡献。该研究得到了国家杰出青年科学基金项目（82125018）的支持。

英文全文链接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad030

引用本文：

Cheng Lyu, Wenyu Kong, Yan Zhang, Zhiqiang Liu, Kaini Liang, Yanan Du, Transglutaminase-crosslinked extracellular matrix in cirrhotic liver tissues provides pro-fibrotic mechano-microenvironment for cells, Life Medicine, 2023, lnad030, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad030