Nature子刊：季泉江团队工程改造Cas12f，提升其基因编辑活性

基于CRISPR的基因编辑工具在疾病治疗等领域拥有重要的应用前景。然而，目前广泛使用的Cas9和Cas12a因其较大的分子尺寸（超过1000个氨基酸）而难以被腺相关病毒（AAV）载体进行高效递送，从而限制了其在基因治疗等领域的应用。为此，研究人员积极寻找分子尺寸更小的CRISPR效应核酸酶。其中最紧凑的一类CRISPR效应核酸酶Cas12f（400-700个氨基酸）因其较小的分子量和较高的编辑活性备受关注。

2020年，Virginijus Siksnys团队证明Cas12f在试管中可以依赖PAM进行双链DNA切割【1】。2021年，Yong-Sam Kim团队，亓磊团队和季泉江团队分别独立证明了Un1Cas12f1（537 氨基酸，识别TTT PAM）【2、3】和AsCas12f1（422 氨基酸，识别TTR PAM）的哺乳动物细胞和细菌编辑活性【4】。

为阐明如此小分子量的AsCas12f1核酸酶具有编辑活性的分子机制和提升其编辑活性，季泉江团队于2023年解析AsCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合体结构，并基于结构进行理性设计，极大提升了其基因编辑效率【5】。然而，AsCas12f1同大多数Cas12f1一样仅识别富T的PAM序列，限制了其靶向范围。因此，亟需开发新的高活性且靶向范围更广的CRISPR-Cas12f系统。Clostridium novyi Cas12f1（CnCas12f1，497氨基酸）对罕见的富C PAM序列具有识别特异性，但人们只在试管中检测到DNA切割活性，并没有发现其具有活细菌内的靶向干扰活性，并且其富C PAM的特异性识别和DNA催化切割机制亦不清晰。

2023年9月11日，上海科技大学季泉江教授团队在 Nature Chemical Biology 期刊发表了题为：Molecular basis and engineering of miniature Cas12f with C-rich PAM specificity 的研究论文。

该研究解析了微型基因编辑系统CRISPR-CnCas12f1的三元复合体的结构，揭示了其独特的结构特征与其识别富C PAM序列并发挥催化作用的分子机制，并通过工程化改造引导RNA，将最初没有编辑活性的CnCas12f1转化为人类细胞中高效的基因编辑工具。

研究人员利用冷冻电镜技术成功解析了CnCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合体的精细结构，揭示了复合体的形成机制，两个CnCas12f1单体以不对称二聚体的形式与引导RNA和目标DNA相互作用形成效应复合物。通过层层解析CnCas12f1二聚体的交互界面，明确了形成二聚体的关键作用力：底层主要由范德华力推动，中间两层则主要通过氢键形成，而顶层则依赖于REC识别结构域的α3螺旋间相互作用实现二聚化。

与同源酶Un1Cas12f1的复合物结构相比，CnCas12f1的REC识别域存在独特的不同于与其它Cas12f酶的延伸螺旋结构，该特殊螺旋对维持其酶活性至关重要。不仅如此，CnCas12f1与AsCas12f1类似，其sgRNA也含有一个独特的共轴RNA螺旋结构，在Un1Cas12f1中被蛋白中额外增加的锌指结构域所替代，表明Cas核酸酶的蛋白结构域与sgRNA之间存在协同进化。

该研究还阐明了CnCas12f1与靶向DNA的相互作用机制，揭示了CnCas12f1通过其识别域REC.1、楔形域WED.1和REC.2来协同识别特定的PAM序列，并通过点突变实验证实了其中5个关键氨基酸残基的重要性。同时，研究人员使用工程化CnCas12f1的“共价二聚体”进行体外切割实验，确定了CnCas12f1的DNA催化切割主要依赖RuvC.1域的活性中心，为优化Cas12f1的基因编辑应用提供了依据。

图1：CnCas12f1识别和切割DNA的分子催化机制

此外，研究人员通过体外实验对CnCas12f1的生化特性和双链DNA切割模式进行了系统的表征。证明CnCas12f1是一个依赖Mg2+且盐浓度敏感的嗜热核酸酶，能够与sgRNA结合后识别并切割含有5'-NCCD（D表示A、G和T）PAM的双链DNA，在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口，形成不对称粘性末端。

为了获得体内活性，研究人员通优化引导RNA的结构，设计出了一个在细菌内具有高活性的单向导RNA（sgRNA_MS1）。进一步系统地对CnCas12f1的sgRNA进行工程化设计，最终获得了在人类细胞中表达更高、编辑活性大幅提升的sgRNA_MS13。表明引导RNA的结构缺陷是限制Cas12f家族核酸酶基因组编辑活性的主要因素，为改进其他Cas核酸酶的活性提供了策略。

图2：引导RNA工程化提高CnCas12f1的基因组编辑活性

该研究又一次拓展了微型CRISPR核酸酶工具库，增进了我们对CRISPR-Cas12f家族的结构生物学理解，为开发适合病毒载体递送的高效微型CRISPR系统提供了重要参考。

值得一提的是季泉江课题组近期还开发了另外一类新颖Cas12n微型基因编辑器，具有不同于CnCas12f（C-rich）和AsCas12f1（T-rich）的AAN PAM识别特性和高效的编辑活性【6】。详情：上海科技大学季泉江课题组博士生苏梦娇、博士后李帆和博士后王玉珏为论文共同第一作者。上海科技大学季泉江教授与助理研究员吴兆韡为论文共同通讯作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-023-01420-4

参考论文：

1. Karvelis, T. et al. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic Acids Res. 48, 5016–5023 (2020).

2. Kim, D. Y. et al. Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nat. Biotechnol. 40, 94–102 (2022).

3. Xu, X. et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol. Cell 81, 4333-4345 (2021)

4. Wu, Z. et al. Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease. Nat. Chem. Biol. 17, 1132–1138 (2021).

5. Wu, Z. et al. Structure and engineering of miniature Acidibacillus sulfuroxidans Cas12f1. Nat. Catal. 6, 695–709 (2023).

6. Chen, W. et al. Cas12n nucleases, early evolutionary intermediates of type V CRISPR, comprise a distinct family of miniature genome editors. Mol. Cell 83, 2768-2780 (2023).

题图为论文通讯作者、上海科技大学季泉江教授

阅读原文