米卫东/仝黎iScience：vlPAG区GABA能神经元通过皮质-中脑环路促进七氟醚麻醉觉醒

原创 Cell Press CellPress细胞科学 

交叉学科

Interdisciplinary

2023年8月14日，解放军总医院第一医学中心麻醉科米卫东/仝黎团队在Cell Press细胞出版社旗下交叉学科期刊iScience上发表了题为“Ventrolateral Periaqueductal Grey GABAergic Neurons Promote Arousal of Sevoflurane Anaesthesia through Cortico-Midbrain Circuit”的研究论文。该团队利用光遗传学、化学遗传学、钙成像等技术结合行为学及脑电分析研究麻醉觉醒过程中以vlPAG区GABA能神经元为中心的皮质-中脑环路参与的调控作用。研究揭示，vlPAG区GABA能神经元在七氟醚麻醉中发挥促觉醒作用，并且利用神经示踪及调控发现mPFC-vlPAG-VTA的皮质-中脑环路是发挥这一作用的环路基础。

本论文由来自解放军总医院第一医学中心米卫东/仝黎课题组，通讯作者为米卫东、仝黎，第一作者为郭永馨、宋燕平、曹福羊。

相关背景

全身麻醉药物的作用机制仍是未解之谜。在全身麻醉诱导的意识消失与恢复过程中，兴奋性和抑制性神经递质的调控作用仍不清楚。中脑被认为是脊椎动物某些意识形式的起源地。中脑导水管周围灰质（PAG），是一个环绕着中脑导水管的重要脑区，在调节疼痛、自主神经系统、防御反应、抑郁和睡眠中发挥着重要作用。腹外侧中脑导水管周围灰质（vlPAG）中的γ-氨基丁酸（GABA）能神经元被认为在调节睡眠状态转换中起到重要作用，但其在全身麻醉调节中的作用及其参与的环路机制尚不清楚。七氟醚是临床最常用的全身麻醉药之一，也是麻醉诱导中最常用的吸入性麻醉药物，揭示七氟醚发挥作用的神经环路机制有重要的临床意义。

结果解读

1.vlPAG区GABA能神经元动力学反映七氟醚麻醉期间的清醒状态

为了研究麻醉觉醒状态下vlPAG区GABA能神经元活性，我们利用钙成像技术检测了核团神经元中的钙信号变化。研究结果表明，在2.0%七氟醚麻醉期间，vlPAG区GABA能神经元钙信号活性逐渐降低；停止麻醉吸入后，钙信号活性逐渐恢复。说明在七氟醚麻醉期间，vlPAG区GABA能神经元的神经元活性受到抑制，并在清醒状态下被激活。此外，我们观察到脑电频谱的变化与2.0%七氟醚维持期间钙信号的升高相关，随着钙信号的升高，δ功率百分比降低，而β和γ频段的功率百分比增高（图1）。

图1. vlPAG区GABA能神经元动力学反映七氟醚麻醉期间的清醒状态

2. 光遗传激活vlPAG区GABA能神经元促进七氟醚麻醉的觉醒

为了研究vlPAG区GABA能神经元在七氟醚麻醉调节中的作用，利用AAV病毒转染光敏通道视紫红质-2蛋白（ChR2）以激活神经元。研究发现光遗传激活vlPAG区GABA能神经元缩短了麻醉恢复时间，而不影响麻醉诱导时间。此外，在2.0%七氟醚麻醉维持期间进行两分钟光刺激，可观察到脑电波形的变化，脑电爆发抑制率（BSR）明显降低。在低浓度1.5%七氟醚麻醉下，两分钟光刺激时，δ波段的功率百分比明显降低，而α波段的功率百分比，β波段和γ波段显著增加。并且观察到行为觉醒评分显著增加。因此，光遗传激活vlPAG区GABA神经元可以引起麻醉维持阶段的觉醒改变，促进七氟醚麻醉的恢复（图2）。

图2. 光遗传激活vlPAG区GABA能神经元促进七氟醚麻醉的觉醒

3.化学遗传调控vlPAG区GABA能神经元可调节七氟醚麻醉后觉醒状态

为证实vlPAG区GABA能神经元在七氟醚全身麻醉下持续调控作用，利用AAV病毒转染毒蕈碱型受体hM3Dq和hM4Di以调控神经元。在七氟醚麻醉开始前1小时，腹膜内注射CNO以特异性激活或抑制vlPAG区GABA能神经元。同样发现vlPAG区GABA神经元的长时程激活对麻醉诱导时间没有影响，但与对照组相比，麻醉恢复时间显著缩短。此外，化学遗传激活可使脑电BSR明显降低。脑电图频谱分析显示，在1.5%七氟醚期间，δ频段功率百分比下降，而θ、β和γ频段显著增加。抑制vlPAG区GABA能神经元可延长苏醒时间。在2.0%和1.5%七氟醚麻醉期间表现为脑电BSR的升高。因此，vlPAG区GABA能神经元的长时程调控也可以影响七氟醚麻醉觉醒状态（图3）。

图3. 化学遗传调控vlPAG区GABA能神经元可调节七氟醚麻醉觉醒状态

4.光遗传激活vlPAGGABA-VTA投射促进七氟醚麻醉的觉醒

为了研究哪些下游核团参与了vlPAG区GABA能神经元觉醒的调节，研究利用顺行病毒示踪发现在腹侧被盖区（VTA），外侧视前区（LPO）和未定带（ZI）中观察到密集的投射表达，团队将光遗传病毒注射于vlPAG中，并将光纤置入VTA，LPO或ZI以刺激GABA能轴突末端。发现光遗传激活vlPAGGABA-VTA投射可促进七氟醚麻醉的觉醒，与激活vlPAG区GABA能神经元作用一致。而光遗传激活LPO和ZI中GABA能神经元末端则对七氟醚麻醉觉醒没有显著影响（图4）。

图4. 光遗传激活vlPAGGABA-VTA投射促进七氟醚麻醉后觉醒

5.光遗传激活mPFCPyr-vlPAG投射可促进七氟醚麻醉后的觉醒过程

对vlPAG区进行逆向示踪显示，其上游主要集中在皮层的mPFC区中。研究利用光遗传学阐明mPFCPyr-vlPAG投射在七氟醚麻醉中的作用。光刺激mPFCPyr-vlPAG投射缩短了七氟醚麻醉后的觉醒时间，而不影响七氟醚麻醉诱导时间。在2.0%七氟醚维持期间，脑电图的BSR在光刺激下显著降低。在1.5%七氟醚维持期间，光刺激可使δ功率百分比降低，而β功率和γ频段显著增加，并且使觉醒行为评分增加。这些结果表明，mPFCPyr-vlPAG投射可促进七氟醚麻醉的觉醒（图5）。

图5. 光遗传激活mPFCPyr-vlPAG投射可促进七氟醚麻醉的觉醒

6.VTA中的GABA神经递质释放与三级投射神经调控变化一致

为了验证mPFCPyr-vlPAGGABA-VTA的三级投射，我们将光遗传学与荧光递质信号成像技术相结合。使用635 nm红光刺激mPFCPyr-vlPAG投射并用473nm蓝光记录VTA中GABA神经递质的释放。研究发现，每秒的光刺激都伴随着荧光信号的增加，表明存在mPFCPyr-vlPAGGABA-VTA的投射。研究进一步研究了VTA在麻醉-觉醒状态下GABA递质的活性变化，发现VTA区GABA递质信号被七氟醚麻醉抑制，并随着七氟醚麻醉消失而逐渐恢复，这意味着VTA区GABA释放可能参与调节七氟醚麻醉觉醒过程（图6）。

图6. VTA中的GABA神经递质释放与三级投射神经调控变化一致

总结

本研究表明，vlPAG区的GABA能神经元在七氟醚全身麻醉调控中发挥关键作用，激活vlPAGGABA 神经元可以促进七氟醚全身麻醉的觉醒，抑制则延长觉醒过程。本研究还揭示了以vlPAG区GABA能神经元为中心的三级投射mPFCPyr-vlPAGGABA-VTA在全麻“Top-Down”机制中的作用。GABA能抑制神经元及其相关神经环路的促觉醒作用可能为探索全麻药物调控意识的形成和维持机制提供新的方向。

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊iScience上

▌论文标题：

Ventrolateral periaqueductal gray GABAergic neurons promote arousal of sevoflurane anesthesia through cortico-midbrain circuit

▌论文网址：

https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(23)01563-8

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.107486

2021年，Cell Press推出了“集体审稿”（Community Review）模式，作者可以选择多本Cell Press旗下期刊同时提交稿件。“集体审稿”模式可以增加您的文稿在Cell Press得到正式同行评审的可能性，同时避免一轮又一轮的评审，缩短从投稿到正式出版所需的时间。

CellPress细胞出版社

阅读原文