下载客户端

广州实验室徐涛院士团队iScience：研究细胞器互作位点蛋白质组的新方法

2023-08-17 11:50

来源：澎湃新闻·澎湃号·湃客

原创 Cell Press CellPress细胞科学

交叉学科

Interdisciplinary

2023年7月16日，广州实验室徐涛院士团队在Cell Press细胞出版社期刊iScience上发表了题为“A Proximity Labeling Strategy Enables Proteomic Analysis of Inter-organelle Membrane Contacts”的论文，提出了一种基于双分子荧光互补技术的邻近标记方法（BiFCPL），在以细胞器互作位点为代表的空间蛋白质组学的研究上具有广阔的应用前景。首先，作者利用这一方法研究了线粒体-内质网互作位点的蛋白质组，鉴定到了403个蛋白质，包含了很多已知的蛋白和大量未被报道的蛋白。随后，作者研究了肝细胞中线粒体-脂滴互作位点的蛋白质组，发现线粒体-脂滴互作对于营养状态极为敏感，并通过比较蛋白质组学的方法筛选到了60个对饥饿刺激敏感的互作位点蛋白。本论文的通讯作者为广州实验室的徐涛院士，第一作者为周茂阁博士。

细胞器不仅有其特定的功能，还能通过膜接触位点（membrane contact site）发生相互作用，形成互作网络，调控离子、脂质和蛋白质的快速交换、细胞器膜重塑以及信号转导等过程。细胞器互作网络的紊乱会导致多种疾病的发生发展，包括2型糖尿病、肿瘤和阿尔茨海默症等。目前常用的基于离心的亚细胞组分分离方法（subcellular fraction analysis）操作繁琐，极易引入不同组分的污染。由于缺乏有效的蛋白质组学研究工具，我们对于细胞器互作的方式、功能和分子机制仍然所知甚少。

面对这一重要问题，徐涛院士团队联用基于split-GFP系统的双分子荧光互补技术（BiFC）和基于APEX2的邻近标记策略（PL），提出了一种研究细胞器互作位点蛋白质组的方法（BiFCPL）。其原理在于：绿色荧光蛋白GFP被分为两个互补片段，分别定位到不同的细胞器膜上，在二者的接触位点，两个片段即可靠近并形成完整的GFP蛋白，指示互作位点。随后，利用GFP纳米抗体（nanobody）和完整GFP蛋白之间的结合将APEX2蛋白招募到互作位点，标记相邻的蛋白质。BiFCPL技术既能发挥双分子荧光互补技术灵敏、简便和可视化的优势，也能发挥邻近标记技术灵敏、精确的特点。

图1 利用BiFCPL技术研究线粒体-内质网互作位点蛋白质组的原理

首先，研究团队利用BiFCPL技术研究了线粒体-内质网互作位点的蛋白质组。浙江大学佟超教授团队利用split-GFP系统建立了指示线粒体-内质网互作位点的U2OS细胞系，在此细胞系的基础上，徐涛院士团队鉴定了线粒体-内质网互作位点的蛋白质组，共得到403个高可信度的蛋白质，包含了很多已知的蛋白和未被报道的蛋白。

图2 利用BiFCPL技术鉴定U2OS细胞线粒体-内质网互作位点的蛋白质组

此前，有研究团队利用双分子互补邻近标记技术（split-proximity labeling），称为contact-ID和split-TurBoID，研究了HEK293T细胞中线粒体-内质网互作位点的蛋白质组，分别鉴定到115和101个蛋白。徐涛院士团队将BiFCPL所得数据与这两种方法做了比较，发现BiFCPL技术具有显著的优势：很多已被广泛报道的蛋白，包括MFN1、MFN2、RMDN3等，包含在BiFCPL所得数据中，而contact-ID和split-TurBoID则仅能检测到这些蛋白中的1到2个。活细胞成像实验表明BiFCPL技术可以鉴定到瞬时定位到互作位点的蛋白。这些证据表明，利用BiFCPL技术可以得到更准确、更完整的互作位点蛋白质组。

此外，研究团队扩展了BiFCPL技术的应用。该团队利用split-GFP系统建立了指示线粒体-脂滴互作位点的肝细胞系，并利用超分辨荧光显微镜和光电联合成像确认了该细胞系的准确性。进一步的研究发现高浓度脂肪酸处理以及饥饿可以显著增强互作结构的发生。该团队鉴定了高浓度脂肪酸刺激和饥饿伴随高浓度脂肪酸刺激两种条件下线粒体-脂滴互作位点的蛋白质组，发现了60个对饥饿刺激敏感的蛋白。其中，胆固醇合成限速酶SQLE在饥饿刺激下会聚集到线粒体-脂滴互作位点，很可能是为了直接利用线粒体产生的ATP合成胆固醇。