​光学精密工程 | 浮游植物明场与荧光双光路同步成像方法

对浮游植物的种类和数量进行鉴别和统计，在检测水域中水质状况、对水域中富营养化程度的判断和水华预警等方面有重要意义，浮游植物的形态学检测方法，具有识别过程直观、分类结果较准确等优点，是浮游植物鉴定及生态学研究的重要手段，但仍存在微型藻图像分辨率不足、相似形态藻细胞难以辨别、易受水中杂质干扰等问题。

藻类精准识别不仅需要大量高清显微成像信息，也需要一些辅助信息，来提高藻类信息的丰富度。浮游植物荧光图像包含丰富的藻类自发荧光色素信息，可有效排除水体杂质干扰、对藻细胞位置准确定位与轮廓分割，并进行藻体色素种类区分，提高藻种鉴别过程中的准确率。目前浮游植物明场-荧光显微图像获取多采用单光路的倒置荧光显微镜成像系统，通过手动操作实现明场与荧光成像模式切换，切换过程中受水体流动和活体浮游植物细胞自身游动等因素影响，显微视野下浮游植物细胞的明场图像与荧光图像存在随机错位现象，明场与荧光图像配准面临较大挑战。

针对这一应用需求, 中科院安光所的徐敏等在《光学 精密工程》（EI、Scopus收录，中文核心期刊，《仪器仪表领域高质量科技期刊分级目录》和《光学和光学工程领域高质量科技期刊分级目录》“T1级”期刊）上发表了题为“浮游植物明场与荧光双光路同步成像方法”的封面文章。 

2023年第12期封面

▍成像系统总体设计

为了提高系统成像分辨率和明场-荧光同步成像效率，作者设计了如图所示的浮游植物明场与荧光双光路同步成像系统，系统成像光路设计遵循高分辨显微成像原则，采用分离成像光方式建立双光路成像结构并保证成像视野的统一，设计透射式明场照明和落射式荧光照明相结合的光源结构，提高光源切换效率，采用对称式光路结构保证了成像焦点的一致。系统由明场成像模块和荧光成像模块组成。明场模块由白光光源、物镜、筒镜、CMOS相机等器件组成，高分辨成像结构实现浮游植物明场图像的采集；荧光模块由两组单色光光源、物镜、分光组件、滤光组件、筒镜、COMS相机等器件组成，双波长LED搭配二向色镜组成落射式光源对藻细胞自发荧光进行激发，实现浮游植物荧光图像的采集。

经过上述设计，系统明场成像流程为使用白光光源照射样品台，藻细胞成像光线由物镜收集，经过分光棱镜反射进入明场成像光路，成像光线由筒镜聚焦后到达明场相机，获得浮游植物明场显微图像；系统荧光成像流程为使用465nm、620nm激光光源分别对样品进行激发，藻细胞产生自发荧光由物镜收集，通过分光棱镜透射后穿过二向色镜、滤光片，由筒镜聚焦后到达荧光相机，获得浮游植物荧光显微图像。

图1：浮游植物明场与荧光双光路同步成像系统

▍浮游植物同步成像实验结果与分析

系统光路成像实验的分辨率测试使用USAF 1951分辨率板进行系统的实际分辨率测试，可分辨至第9大组第3元素，即每1mm的可分辨线对数为645，条纹宽度为0.78μm，根据瑞利判据，光学系统中分辨率极限为可分辨两点的最小间距，即线对的宽度1.56μm。利用本系统获取直链藻、多甲藻、栅藻、念珠藻、铜绿微囊藻等五种藻类的明场与荧光显微图像如图2所示。由图可知明场显微图像中不同藻细胞粒径从大于20μm到小于5μm，获取的藻细胞色彩分明，细胞边缘清晰可见，形态特征差异明显，实现了藻细胞丰富形态信息的获取。不同藻种富含的色素种类繁多且含量各异，可以根据不同波段荧光强度判断何种色素含量更为丰富，获取藻细胞色素含量特征信息。

图2：不同藻种明场与荧光显微图像

进一步分析明场-荧光的融合图像如图3所示，死亡藻细胞残留细胞壁和杂质均无荧光图像，如图3中虚线框所示，据此可快速排除图像中的死藻细胞和杂质等干扰信息；活体藻细胞明场图像轮廓与荧光图像轮廓紧密贴合、边缘轮廓清晰，如图3中实线框所示，可快速定位藻细胞位置和轮廓，提高藻细胞分割、提取和识别过程中的准确率。

图3：明场荧光融合图像中的藻细胞

▍工程应用前景

该技术实现浮游植物显微图像下的明场形态信息和色素荧光信息同步采集，有效降低了拍摄延时，提高了明场与荧光图像拍摄和融合效率。系统可快速获取浮游藻类明场-荧光融合图像，有效排除样品中杂质干扰，快速定位藻细胞位置和轮廓，提高藻细胞分割、提取和识别准确度，可应用于藻细胞识别、藻细胞计数、细胞活性判断等领域。

▍团队负责人介绍

赵南京，研究员，博士生导师，主要环境光学检测技术研究。在污染物多组分、快速、高灵敏检测新技术与新方法方面取得了系列创新性研究成果，在关键技术研究中多次取得突破，研发了系列环境污染物多要素快速原位现场和连续自动监测设备，多项成果达到国际先进水平。在 Opt.Express AppliedOptics等学术期刊发表 SCI/EI论文120余篇，已获发明专利授权43项。获国家科技进步二等奖2项，安徽省科学技术一等奖3项，中国环境科学学会青年科技奖等荣誉。兼中国光学学会环境光学专业委员会委员、中国光学工程学会激光诱导击穿光谱(LIBS)专业委员会常务委员、中国海洋学会海洋技术装备专业委员会委员、中国光学工程学会海洋光学专家委员会委员、安徽省光学学会理事等。

▍团队介绍

中科院安光所赵南京研究员课题组围绕国家环境保护战略需求，主要从事于水体和土壤的环境光学监测技术和方法研究，创新研发了系列水体及土壤污染物环境光学监测技术与装备，包括水体重金属有机污染物，浮游生物快速原位/在线，土壤重金属及有机物等现场快速监测技术与装备，多项成果达到国际先进水平，实现产业化及应用。并承担了国家重点研发计划、国家“863”计划、国家科技重大专项（水专项）、国家自然科学基金、中科院STS计划以及省科技攻关重大、省杰出青年科学基金等项目20余项。

▍论文信息

徐敏,殷高方,赵南京等. 浮游植物明场与荧光双光路同步成像方法[J].光学精密工程,2023,31(12):1725-1734.

https://ope.lightpublishing.cn/thesisDetails#10.37188/OPE.20233112.1725

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