舒跃龙/曾小伟/严华成团队：一种微针递送甲型流感广谱DNA纳米疫苗的策略

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Physical science

近日，中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所所长舒跃龙教授联合中山大学曾小伟副教授、中国人民解放军南部战区疾控中心严华成主任在Cell Press细胞出版社期刊Cell Reports Physical Science上发表了一篇题为“A microneedle-based delivery system for broad-protection seasonal influenza A DNA nanovaccines”的论文，该论文被评选为封面论文。该研究通过微针递送甲型流感广谱DNA纳米疫苗在小鼠体内引起了良好的免疫反应。中山大学硕士研究生汪亮亮和博士研究生杨莉为论文的共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和深圳市科创委项目的支持。

研究背景

甲型流感（influenza A virus，IAV）是威胁人类健康的重大公共卫生问题之一，感染人类的主要是H1N1和H3N2亚型，在人群中常呈季节性流行。预防流感最有效的措施是接种疫苗。而由于IAV的血凝素（hemagglutinin，HA）容易发生抗原漂移，导致当前疫苗有效性会降低。此外当前疫苗生产周期长、运输和储存要求高以及需要大量医护人员实施接种。因此，迫切需要开发一款能快速生产、运输和储存方便和能自主接种的甲型流感广谱疫苗。DNA疫苗仅需要抗原序列即可进行灵活设计，稳定性高而成为广谱流感疫苗研发的重要平台之一。本研究团队前期通过马赛克免疫原设计策略设计出了针对甲型流感H1N1和H3N2的两条具有潜在广谱性的HA抗原序列，分别为mH1和mH3。然而，DNA疫苗的免疫原性较低限制了其应用。基于聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）的非病毒载体被广泛用于基因递送研究以增强免疫反应，PEI的分子量越大，其转染效率越高，但其细胞毒性也越强。需要对其改进以平衡细胞毒性和转染效率。另外，由于皮肤微环境中存在大量的抗原提呈细胞，所以使用微针（microneedles，MN）经皮免疫成为一种有效的疫苗递送方式，同时微针接种方便，可自主接种。因此基于前期马赛克免疫原设计策略获得的广谱免疫原，本研究利用微针递送系统研发一种具有潜在临床应用前景的广谱DNA疫苗。

主要结果

本研究通过内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）将潜在广谱性序列mH1和mH3的序列连接到同一载体中构建甲型流感HA DNA疫苗，通过IRES将绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）和红色荧光蛋白（monomeric red fluorescent protein，mRFP）连接到同一载体中构建荧光载体，用于下一步的筛选。

通过PEI和脱氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）的缩合反应合成纳米材料DCA-PEI，将DCA-PEI与DNA以一定质量比混合制备纳米粒。使用不同质量比（2:1，4:1和6:1）的纳米粒通过荧光筛选得出以2:1的质量比制备的纳米粒体外转染效率最高。接下来的研究采用该方案制备的纳米粒进行展开。

通过透射电子显微镜和纳米粒度分析仪进行纳米粒物理表征，结果显示纳米粒呈球形，粒径大小平均为133 ± 0.45 nm，Zeta电位为正电荷（图1）。通过溶酶体逃逸实验证明了纳米粒的内体逃逸能力（图2）。

图1. 纳米粒物理表征

注：（A）纳米粒的电镜图；（B）纳米粒的粒径大小；（C）纳米粒的电位

图2. 溶酶体逃逸实验

注：Rhodamine用于标记纳米粒（红色），Lysosome用于标记溶酶体（绿色），BF代表明场，Colocalization代表共定位，图中数字代表共定位系数。

使用离心灌注法将纳米粒载进微针，通过载药分布实验对微针进行表征，结果显示疫苗主要分布在微针的针尖部位（图3）。最后，在小鼠体内，分别使用微针注射和肌肉注射（intramuscular injection，IM）两种方式来递送裸DNA疫苗和DNA纳米疫苗，免疫实验表明，与其它任何组相比，微针递送甲型流感广谱DNA纳米疫苗组在小鼠中引起的CD4+IFN-γ+ T细胞、CD8+IFN-γ+ T细胞、滤泡辅助T细胞（follicular helper T cells，Tfh）和生发中心B细胞（germinal center B cells，GC B）比例均最高（图4）。针对6种代表性甲型流感病毒的血凝抑制实验（hemagglutination inhibition test，HAI）也表明，与其它任何组相比，微针递送甲型流感广谱DNA纳米疫苗组在小鼠中的HAI抗体滴度均最高（图5）。

图3. 微针形貌及载药分布图

注：BF表示明场；Flu表示荧光场；左边放大倍速为30×，右边放大倍速为150×。红色表示Rhodamine标记的纳米粒。

图4. 细胞免疫和生发中心反应

注：（A和B）在病毒A/PR/8/1934(H1N1)刺激下脾脏中CD4+IFN-γ+ T细胞和CD8+IFN-γ+ T细胞的数量占比；（C和D）在病毒A/Aichi/2/1968(H3N2)刺激下脾脏中CD4+IFN-γ+ T细胞和CD8+IFN-γ+ T细胞的数量占比；（E和F）脾脏中滤泡辅助T细胞（follicular helper T cells，Tfh）和生发中心B细胞（germinal center B cells，GC B）的数量占比。IM表示肌肉注射，MN表示微针注射，nano表示纳米。

图5. 交叉体液反应

注：（A）使用病毒A/PR/8/1934（H1N1）检测的HAI抗体水平；（B） 使用病毒A/California/7/2009（H1N1）检测的HAI抗体水平；（C） 使用病毒A/Victoria/2570/2019（H1N1）检测的HAI抗体水平；（D） 使用病毒A/Aichi/2/1968（H3N2）检测的HAI抗体水平；（E） 使用病毒A/Hong Kong/4801/2014（H3N2）检测的HAI抗体水平；（F）使用病毒A/Hong Kong/2671/2019（H3N2）检测的HAI抗体水平。IM表示肌肉注射，MN表示微针注射，nano表示纳米。

综上所述，本研究首先构建了甲型流感DNA疫苗，然后合成材料DCA-PEI，该材料能够与DNA形成纳米粒，提高了DNA在体外转染效率，基于微针注射甲型流感广谱DNA纳米疫苗免疫小鼠后激发了有效的免疫反应，这为广谱流感疫苗的研发和疫苗递送系统的研发提供了新策略。

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下

期刊Cell Reports Physical Science上，

▌论文标题：

A microneedle-based delivery system for broad-protection seasonal influenza A DNA nanovaccines

▌论文网址：

https://www.cell.com/cell-reports-physical-science/fulltext/S2666-3864(23)00204-7

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.xcrp.2023.101430

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