Life Med | 朱芳芳/吴晨发现人血小板裂解物可诱导分化自然杀伤细胞

2023年3月13日，Life Medicine杂志以letter形式在线发表了题为“Human platelet lysate as a substitute for serum in natural killer cell generation and expansion”的研究，该研究以人血小板裂解物（hPL）替代人AB血清（ABS）作为造血干细胞（HSC）分化自然杀伤细胞（NK）过程中的添加剂，并研究了分化过程中细胞形态、增殖、活率以及表面标志物表达，同时比较了两种添加剂来源的NK细胞对常见肿瘤细胞的杀伤效果。该研究首次证明了人血小板裂解物（hPL）可作为添加剂诱导人HSC体外定向分化为NK细胞。该研究为NK细胞治疗领域提供了一种无血清的分化体系，具有重要的转化意义。

NK细胞治疗作为一种新兴的癌症免疫疗法备受关注，如何稳定、高质量并大规模地获取这种细胞已成为癌症研究和产业化领域的热点问题。现有的获取方式已经不足以满足需求，因此一种以诱导多能干细胞（iPSC）和HSC为起始原料，通过定向诱导分化NK细胞的方法被提出。这种方法利用了iPSC和HSC的可编辑属性，通过加入嵌合性抗原受体（CAR）为治疗恶性肿瘤带来巨大的希望。然而，现有的诱导分化方法中普遍使用ABS或者胎牛血清（FBS）作为培养基的添加剂，这些添加剂具有成份复杂、稳定性差、含有动物源成分等缺陷，不能满足临床级别的细胞生产需求。因此，亟需开发一种无血清替代物来满足临床级生产和应用需求，同时保障其高性能和高产能。血小板α颗粒中含有许多细胞因子，制备的hPL已被证明是FBS的良好替代品，可用作培养基添加剂，满足人类细胞在无血清条件下高效繁殖。研究表明，hPL可用于体外扩增间充质干细胞（MSC）和NK细胞，但hPL尚未在iPSC或HSC体外定向诱导分化成NK细胞的过程中得到应用。

研究人员首先使用明场观察和吉姆萨染色技术观察了分化过程中的细胞，发现添加hPL和AB血清均能够促进NK细胞的表型成熟（图1A-B）。此外，在不同时间点监测细胞数量和活率，发现在D17之前，两组添加剂对细胞增殖没有显著影响，但在D17之后，添加hPL显著促进了细胞增殖，而两组细胞的细胞活率没有显著差异（图1C-D）。

图1. 不同添加剂对HSC诱导NK细胞分化过程中的细胞形态，增殖以及活率的影响

在分化终末阶段，研究人员对NK细胞表面抗原进行了检测，发现hPL诱导的NK细胞（hPL-NK）相较于ABS诱导的NK细胞（ABS-NK）产生了更多比例的CD56+CD16+细胞，并且多分化出一群更为成熟的CD56dimCD16+ NK细胞。这表明hPL相较于ABS可以显著促进NK细胞的成熟。此外，作者还发现hPL-NK的CD335+CD56+细胞比率显著高于ABS-NK，而CD336+CD56+细胞比率显著低于ABS-NK。（图2）

图2. hPL作为添加剂对NK细胞相关表面抗原表达的影响

在接下来的实验中，研究人员使用了一种血液瘤细胞系(K562)和两种实体瘤细胞系(HepG2和A549)来评估两组NK细胞的杀伤能力。结果表明，hPL-NK和ABS-NK对于K562和HepG2的杀伤能力相似，但是hPL-NK对于A549的杀伤能力明显优于ABS-NK（图3）。

图3. hPL作为添加剂对NK细胞杀伤功能影响

为了研究hPL促进NK细胞分化的潜在分子机制，研究人员对外周血分离的NK细胞（PB-NK），hPL-NK和ABS-NK进行了全转录组测序。通过基因表达热图和主成分分析（PCA）发现，hPL-NK和ABS-NK的基因表达在总体水平上表达类似，而PB-NK与hPL-NK在PC2（主成分2）维度更为接近说明两者某些基因的表达水平更接近。火山图分析显示， NK细胞功能性蛋白如CD16，CD86，CD74，CD79b，TBX21，CD247，IL21R等在hPL-NK和PB-NK中的表达显著高于ABS-NK。GO富集分析显示，PB-NK和hPL-NK相较于ABS-NK上调的基因主要富集于免疫应答，细胞激活以及免疫细胞介导的细胞毒性等通路。研究人员通过绘制基因表达差异热图，分别分析了四类（1.NK激活受体2.抑制受体3.NK细胞发育和成熟4.细胞毒性）与NK功能相关的基因表达差异。结果表明，hPL-NK与PB-NK在NK发育与成熟和细胞毒性相关基因的表达方面更为接近（图4）。以上结果表明hPL在促进NK细胞成熟和细胞毒性方面优于ABS。

图4. hPL作为添加剂对NK功能性相关基因表达的影响

综上所述，该研究评估了在HSC定向分化NK细胞过程中使用hPL作为无血清添加剂替代ABS的可行性。相较于ABS，hPL对细胞形态和活率没有显著性影响，而在细胞增殖方面有显著提升。同时本研究还发现hPL可以显著提升CD56+CD16+NK细胞的比例，证明了hPL有助于NK细胞的成熟且潜在提高其对某些类型肿瘤细胞（如A549）的杀伤能力。总之，以血小板裂解物作为添加剂有助于产业化生产临床级别的NK细胞，具有重要的转化意义。它可以提高细胞培养的效率和产量，降低生产成本，促进生物制药和生物医学领域的发展。此外，血小板裂解物作为一种添加剂，其安全性和生物相容性较高，降低对生物制品产生污染和副作用。

引用本文：

Chao Li, Hao Zhu, Lei Zhang, Xianwei Liu, Yibing Ji, Haihong Zhang, Zhongpeng Li, Chen Wu, Fangfang Zhu, Human platelet lysate as a substitute for serum in natural killer cell generation and expansion, Life Medicine, Volume 2, Issue 2, April 2023, lnad011, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad011

原文链接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad011