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【学术前沿】Cell文章：孟飞龙组揭示DNA柔性在抗体基因超突变中的生理功能

2023-04-25 17:03

来源：澎湃新闻·澎湃号·政务

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北京时间4月24日，国际学术期刊Cell以Research Article的形式在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）孟飞龙（中国细胞生物学学会青年工作委员会委员）研究组的最新成果“Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation”。该研究基于经典生化方法与高通量测序技术，建立了体外检测抗体基因超突变的一系列新方法，从而揭示了抗体基因互补决定区（CDR）通过高度柔性特征引发超高突变的分子机理。胞苷脱氨酶AID在B淋巴细胞中启动了抗体基因超突变，其蛋白表面具有大片正电荷片区；而抗体基因CDR编码区域DNA序列则在进化中获得了高度柔性的特征。酶与底物的协同进化共同促进了CDR区的超突变偏好。该工作为下一代抗体基因人源化动物模型的设计提供了底层理论。

抗体作为适应性免疫系统中的关键效应分子，时刻守卫着机体的健康。面对复杂多变的外界环境，机体的免疫系统通过抗体多样化机制产生数量庞大的抗体分子，从而特异性地识别和清除病原体。抗体多样化通常包含两个主要步骤，（1）核酸内切酶RAG介导的的V(D)J重排过程；（2）胞苷脱氨酶AID起始的体细胞超突变（SHM）和抗体类型转换（CSR）过程。体细胞超突变可在抗体基因的可变区编码区引入高频突变。但是，超突变在抗体可变区外显子上并非均匀分布，而偏好性积累在可变区中的互补决定区（CDR）。超突变为什么具有偏好性，在上世纪八十年代由著名免疫学家David Baltimore与Klaus Rajewsky提出。40多年来，这一领域尝试从多个角度去解释这一现象，但一直都没有令人非常信服的结论。CDR偏好突变科学问题的解决亟需引入新的概念。胞苷脱氨酶AID是一个仅含198个氨基酸的蛋白质。生化实验证明AID作用于单链DNA底物，并且偏好作用于WRC（W=A/T, R=A/G）基序。但是WRC基序并不能解释抗体基因CDR偏好超突变，因为同样的WRC基序在CDR编码区突变率超高。在CDR编码区的中尺度（5-50bp）中，AID可能受到局部序列的调控。

孟飞龙研究组长期致力于免疫受体多样化机制研究。在最新的这项研究中，他们从经典的生化方法出发联合高通量测序技术，首先建立了体外检测抗体基因突变的新体系，发现AID酶活反应重现了小鼠体内抗体基因突变谱式。随后，他们将生化实验的DNA底物扩展到27种有颌脊椎动物的1000余条抗体基因序列，发现CDR突变偏好在使用体细胞高频突变（SHM）作为抗体主要多样化策略的四足动物（包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鸭嘴兽以及羊驼等）中高度保守。那么这种突变偏好是否受DNA序列上下文的影响呢？

CDR偏好突变在多个物种中高度保守

为了回答这个问题，研究人员在小鼠体内将一段抗体基因的DNA序列进行随机置换，发现序列改变后突变频率发生了显著变化。这一结果提示不同的DNA序列上下文中可能含有未知的中尺度顺式因子，从而调控突变频率的作用。因此，研究人员通过基因编辑在CDR3区引入随机序列改变，快速获得了十几种携带不同CDR3序列环境的小鼠模型，发现序列改变越靠近CDR3区内的突变热点对该位点的突变频率影响越大。因此，研究人员继续将序列上下文范围缩小到突变位点上下游各12-15 nt。

CDR3区域DNA序列上下文的改变影响突变频率

通过分子动力学模拟和多种单分子生化实验，研究人员发现中尺度中DNA序列柔性越大越有利于结合AID表面的正电荷片区，进而越有助于突变的发生。单链DNA的柔韧性与嘧啶-嘧啶二核苷酸的含量呈正相关。此外，通过分析抗体基因序列特征以及突变谱式，研究人员发现抗体基因CDR的编码序列在进化中获得了高度柔性的特征。最后，研究人员分别在B细胞系和小鼠体内将一段柔性序列插入突变低频区FR，发现柔性序列极大地提高了FR的突变频率。

DNA序列柔韧性对突变频率的影响

柔性序列的人工合成可将“冷”突变区转变为突变“热”点

综上，该研究解答了长期困扰这一领域的难题，发现抗体基因CDR编码区DNA柔性促进了偏好性突变的发生，抗体基因编码序列具有调控AID突变靶向的非编码功能。这一工作为DNA力学性质参与调控细胞生命过程提供了例证，也提示DNA柔性等力学性质可能在其他生命活动如肿瘤的发生发展中发挥重要作用。中尺度序列特征的发现，为设计下一代抗体基因人源化动物模型构筑了底层理论。

分子细胞科学卓越创新中心博士生王燕燕为该论文的第一作者，中心孟飞龙研究员和上海交通大学医学院叶菱秀研究员为该论文的共同通讯作者。上海师范大学数学系博士生张森欣在数据分析，上海交通大学博士生杨欣瑞在分子动力学模拟，哈佛大学Joyce Hwang和王宠在模型构建等方面作出重要贡献。该工作得到上海交通大学达林泰教授、上海交通大学医学院郑小琪教授、哈佛大学医学院Frederick W. Alt教授、中国农业大学赵要风教授、瑞典卡罗林斯卡研究所Qiang Pan-Hammarström教授、中国科学院杭州医学所宋杰研究员、中国科学院生物物理研究所黄韶辉研究员、复旦大学曹志伟教授、分子细胞科学卓越创新中心刘珈泉研究员等合作实验室老师和同学的大力支持。该工作得到分子细胞科学卓越创新中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台、分子生物学技术平台的支持，同时得到来自基金委、科技部、中国科学院、上海市科委等部门的经费支持。