《自然·免疫学》：瘤内NK细胞惨遭“剁手”

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要不是亲眼看到，我真不敢相信肿瘤对自然杀伤（NK）细胞的影响竟然如此之大。

近日，由中国科学技术大学魏海明、郑小虎、田志刚和黄光明领衔的研究团队，借助多种先进的成像技术研究了肝癌对瘤内NK细胞的影响，相关研究成果发表在著名期刊《自然·免疫学》上[1]。中国科学技术大学郑小虎和中国科学技术大学附属第一医院的侯壮豪为论文的共同第一作者。

他们发现与肝脏和外周正常NK细胞相比，肝癌患者瘤内NK细胞的膜突起大幅较少；而且这些缺失了膜突起的瘤内NK细胞无法识别肿瘤细胞，无法形成免疫突触，也因此丧失了抗癌能力。

他们还揭示了NK细胞膜突起缺失的原因，是肿瘤丝氨酸代谢失调，导致瘤内NK细胞膜鞘磷脂（SM）水平下降，难以形成膜突起。好消息是，鞘磷脂酶抑制剂可促进NK细胞膜突起的形成，恢复NK细胞的抗癌能力。

论文首页截图

NK细胞作为一种先天性免疫细胞，是人体第一道免疫防线的重要组成部分。由于它存在强大的非特异性免疫杀伤作用，近年来颇受肿瘤免疫学家的关注。

与其他免疫细胞不同，正常情况下NK细胞膜表面有非常多的突起，这些突起像手一样，帮助NK细胞寻找癌细胞等目标，并借此与癌细胞之间形成免疫突触，进而裂解癌细胞[2,3]。

不同类型免疫细胞示意图

然而，大量研究表明，在肿瘤微环境中，NK细胞识别和裂解肿瘤细胞的能力非常低[4,5]。如此看来，与杀伤性T细胞一样，瘤内NK细胞也难逃免疫抑制的命运。

魏海明等想弄清楚的问题是：瘤内的NK细胞到底怎么了，为何会失去裂解癌细胞的能力。

他们先获取了三种不同来源的NK细胞：肝癌患者瘤内NK细胞，肝癌患者正常肝脏的NK细胞，以健康供体外周血中的NK细胞。然后，他们在透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下观察不同来源NK细胞的变化。

成像结果让他们感到意外：外周和肝脏NK细胞膜表面有大量的突起，突起长190到360纳米，直径为90到170纳米；然而，从肿瘤中分离的NK细胞的膜表面只有很少的突起，简直可以说是光溜溜的啥也没有，即使有个别突起存在，也相对较短，长度在40-130纳米之间。

不同来源NK细胞表面的突起

值得注意的是，这不是肝癌独有的现象。他们发现肺癌、结肠癌和卵巢癌患者的瘤内NK也有类似的特征。

瘤内NK细胞膜的突起哪里去了？失去膜突起，对NK细胞又有何影响？

他们先研究了后一个问题。在将上述三种不同来源的NK细胞与肝癌细胞系HepG2共培养了1-4小时后，他们发现几乎所有来源于肝脏和外周的NK细胞都与肝癌细胞结合了，然而50-79%的瘤内NK细胞却没有靠近肝癌细胞。

不同来源NK细胞与癌细胞的相互作用

高倍率SEM成像的辅助下，他们注意到，肝脏和外周NK细胞都与癌细胞连体了，形成了免疫突触；然而，虽然有少数瘤内NK细胞与肝癌细胞靠在一起，但似乎并没有形成免疫突触。

高倍率成像下，不同来源NK细胞与癌细胞的相互作用

他们还用TEM在×60000放大倍率下对NK细胞和肝癌细胞的结合进行了成像，这让我们有幸一睹免疫突触的真实面目。

成像结果显示，肝脏和外周NK细胞的膜突起向肝癌细胞那一侧极化，明显形成了免疫突触；而瘤内NK细胞大部分情况下根本就没有接触到肝癌细胞，即使有接触的细胞也没有极化现象和免疫突触形成。

不同来源NK细胞与癌细胞之间的免疫突触

这似乎是个不好的征兆。

果不其然，与外周和肝脏NK细胞相比，瘤内NK细胞的杀伤活性大幅下降。

这前半部分实验证实，肿瘤内的NK细胞膜突起大幅减少，这导致NK细胞失去了建立免疫突触的能力，于此以来，NK细胞也就丧失了裂解癌细胞的能力。

要想帮助瘤内NK细胞恢复裂解能力，还得搞清楚癌细胞究竟使用什么手段让NK细胞的“手”全没了。

于是，他们将TEM的放大倍数提高到×10万倍，发现与肝脏和外周NK细胞相比，瘤内NK细胞膜的电子密度明显下降。这一现象表明，瘤内NK细胞膜的组成可能与肝脏和外周NK细胞膜有很大的区别。

不同来源NK细胞膜电子密度比较

看来得研究不同来源NK细胞膜的组成了。

他们在之前的研究基础上，开发了一种叫做单免疫细胞质谱（sIC-MS）的方法，来了解单细胞水平的膜成分。他们对不同来源的NK细胞进行sIC-MS分析，发现与肝脏和外周NK细胞相比，瘤内NK细胞的鞘磷脂水平明显降低，而其他膜成分的水平没有差异。

众所周知，鞘磷脂是细胞膜的重要组成部分，对于细胞膜结构的维持有重要的作用。那么问题就来了，NK细胞膜突起的形成与鞘磷脂水平的变化究竟有没有关系呢。

他们用鞘磷脂合成酶的小分子抑制剂D609和针对这个酶的小干扰RNA（si-SGMS1），分别处理外周NK细胞24小时，以降低外周NK细胞膜的鞘磷脂水平。

结果发现，抑制鞘磷脂的合成明显抑制了外周NK细胞膜突起的形成，膜的电子密度也降低了。TEM、SEM和CLSM的成像结果表明：抑制鞘磷脂合成后，外周NK细胞膜突起的数量和长度都减少了，免疫突触也无法形成了。

这说明呀，鞘磷脂就是影响NK细胞膜突起形成的关键分子。

抑制鞘磷脂的合成，外周NK细胞失去膜突起，且不易与癌细胞形成连接

体外细胞实验还发现，抑制鞘磷脂的合成降低了NK细胞裂解肝癌细胞的能力和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）作用。

那么瘤内NK细胞膜的鞘磷脂又因何减少呢？

原来肿瘤微环境中丝氨酸代谢失调，导致NK细胞内丝氨酸水平较低，而丝氨酸是鞘磷脂生物合成的关键原料。因此，瘤内NK细胞没有充足的鞘磷脂搭建细胞膜。

既然瘤内NK细胞鞘磷脂合成不足，那如果减少鞘磷脂的分解是不是可以恢复NK细胞的战斗力呢？

让人欣喜的是，鞘磷脂酶抑制剂LCL521和GW4869都能显著增加瘤内NK细胞鞘磷脂的水平，并显著增加膜突起形成。

与未经处理的瘤内NK细胞相比，鞘磷脂酶抑制剂可以显著提高瘤内NK细胞识别肝癌细胞和形成免疫突触的能力，还能提高瘤内NK细胞裂解癌细胞的能力。

为了测试鞘磷脂酶抑制剂的抗癌效果，他们在肝癌小鼠模型上测试了鞘磷脂酶抑制剂联合Tim3（NK细胞的免疫检查点）抑制剂的抗癌效果。研究结果让人振奋，虽然两个单药也表现出一定的抗癌活性，但是GW4869/Tim3抑制剂联合疗法发挥的抗癌效果优于任何一种单药疗法。

联合用药的抗肿瘤效果

总的来说，中科大团队的这项研究成果让我们目睹了肿瘤对NK细胞的破坏：肿瘤通过丝氨酸代谢失调的方式，拉低NK细胞膜鞘磷脂的水平，抑制了膜突起的形成，导致NK细胞无法识别癌细胞，也无法与癌细胞形成免疫突触，最终丧失了裂解癌细胞的能力。

这个研究也为肝癌等癌症的免疫治疗指出了新方向，鞘磷脂酶抑制剂联合免疫检查点抑制剂，有望成为一种新疗法。

参考文献：

[1].Zheng X, Hou Z, Qian Y, et al. Tumors evade immune cytotoxicity by altering the surface topology of NK cells. Nat Immunol. 2023. doi:10.1038/s41590-023-01462-9

[2].Orange JS. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nat Rev Immunol. 2008;8(9):713-725. doi:10.1038/nri2381

[3].Williams GS, Collinson LM, Brzostek J, et al. Membranous structures transfer cell surface proteins across NK cell immune synapses. Traffic. 2007;8(9):1190-1204. doi:10.1111/j.1600-0854.2007.00603.x

[4].Zheng X, Qian Y, Fu B, et al. Mitochondrial fragmentation limits NK cell-based tumor immunosurveillance. Nat Immunol. 2019;20(12):1656-1667. doi:10.1038/s41590-019-0511-1

[5].Habif G, Crinier A, André P, Vivier E, Narni-Mancinelli E. Targeting natural killer cells in solid tumors. Cell Mol Immunol. 2019;16(5):415-422. doi:10.1038/s41423-019-0224-2

本文作者丨BioTalker

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