Life Med | 于洋/范勇利用人类孤雌胚胎干细胞构建类囊胚并探索印记和X染色体失活分子特征

未受精的卵母细胞自发激活将会导致孤雌生殖，因此孤雌胚胎的基因组完全来源于母本，缺乏父本遗传信息。在体外，可以通过电刺激和化学试剂人工激活卵母细胞实现孤雌胚胎早期发育。研究者已经成功从孤雌胚胎中建立了孤雌胚胎干细胞，孤雌胚胎干细胞不仅具有与受精胚胎干细胞相似的形态特征和关键分子标志物的表达，同时具有三胚层分化潜能。但是体内研究发现小鼠孤雌胚胎在中期原肠运动前发育阻滞，因此可以作为探索胚胎发育停滞的研究模型，特别是印记基因和X染色体失活可能扮演重要的角色。小鼠孤雌胚胎的体内体外发育特征以及基因组印记的动态变化已经研究清楚，但基因组印记在人类早期胚胎，特别是孤雌胚胎发育中的动态和可能的分子特征还缺乏系统研究。近年来，人类多能干细胞诱导形成的类囊胚（blastoids）成为研究人类早期发育的重要模型，解决了人类胚胎使用的伦理和数量限制难题，也为探索人类孤雌胚胎发育的分子特征提供了契机。

2023年2月，北京大学第三医院于洋课题组与广州医科大学附属第三医院范勇课题组合作在Life Medicine杂志在线发表了题为Generation of blastoids from human parthenogenetic stem cells的研究论文。研究人员利用孤雌胚胎干细胞（human parthenogenetic embryonic stem cells, hPg-ESCs）获得的扩展潜能干细胞（hPg-ESC-derived extended pluripotent stem cells, hPg-EPSCs）通过3D诱导方案构建孤雌类囊胚（hPg-EPSCs blastoids）。形态学、胚胎谱系标记物表达和单细胞转录组分析显示hPg-EPSCs blastoids含有与受精囊胚相似的三种细胞谱系，并且上述特征与人类双亲胚胎干细胞来源的blastoids（hBp-EPSCs blastoids）相似，同时阐明hPg-EPSCsblastoids和hBp-EPSCsblastoids中印记基因和X染色体失活的关键分子特征，为探索胚胎发育中基因组印记变化和人类印记基因疾病提供了研究模型。

hPg-ESCs的特征鉴定

首先，研究人员通过形态学和分子标志物表达，确证hPg-ESCs的多能性特征。hPg-ESCs具有典型的胚胎干细胞形态特征，并且表达多能性分子标志物OCT4和SOX2，及干细胞特异表面标志物SSEA-4和TRA-1-60。进而，根据印记基因的表达情况，确证hPg-ESCs的孤雌特征。并根据课题组建立的诱导方案 ，将hPg-ESCs转变为hPg-EPSCs。

在3D条件下诱导hPg-EPSCs-blastoids

随后，研究人员将hPg-EPSCs诱导为hPg-EPSCs blastoids。为了提高构建效率，使用BMP4，A83-01，PD173074（BAP）预先诱导hPg-EPSCs为TE样细胞，再与hPg-EPSCs在3D微孔板中共培养。在5-6天后，细胞聚集体显示出典型的囊胚形态。免疫荧光显示hPg-EPSCs blastoids外层细胞表达GATA3（TE特异分子），内层细胞高表达SOX2（EPI特异分子），并且在内层细胞外有表达GATA6（PrE特异分子）的细胞包围。

Blastoids在day 6的转录组情况

进一步，研究人员对hPg-EPSCs blastoids进行单细胞转录组分析。经过UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）分析和特定谱系标记物表达水平，可以将hPg-EPSCs blastoids中的细胞分成四群，分别是EPI/ICM，PrE，TE和中间（IM）亚群。

最后，对hPg-EPSCs blastoids的基因组印记和X染色体情况进行分析。其中，对hPg-EPSCs blastoids和hBp-EPSCs blastoids中X染色体失活相关基因和X染色体上基因的表达进行比较分析发现，灵长类特异性非编码RNA-XACT（X Active Specific Transcript）表达较弱，而XIST（X Inactive Specific Transcript）表达水平较强，相似的，XIST的调节因子JPX，FTX的表达水平也较高。XACT，XIST及其调节因子JPX，FTX在两种blastoids中没有明显差异。相似的是X染色体上基因的表达也没有明显差异。

总的来说，研究人员建立了孤雌类囊胚的新模型，hPg-EPSCs blastoids有与受精囊胚相似的形态、细胞谱系组成和转录特征，部分重现了受精囊胚的早期发育事件。该研究模型对于探索人类早期胚胎发育过程中基因组印记和X染色体失活具有重要意义。

北京大学第三医院于洋研究员、广州医科大学附属第三医院范勇研究员和闵喆莹博士为本文的共同通讯作者，博士研究生钟科和罗宇欣为本文的第一作者。

英文全文链接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad006

引用本文：

Ke Zhong, Yu-Xin Luo, Dan Li, Zhe-Ying Min, Yong Fan, Yang Yu, Generation of blastoids from human parthenogenetic stem cells, Life Medicine, 2023;, lnad006, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad006