【科技前沿】中国科学院王艳丽/孙伟发现一种新的dsDNA模拟物，通过阻断PAM识别抑制Cas9

抗CRISPR蛋白由噬菌体编码，抑制宿主的CRISPR - Cas系统。AcrⅡC5能够抑制几种天然II-C型Cas9酶，包括脑膜炎双球菌( Nme1Cas9 )和西蒙斯菌属muelleri ( SmuCas9 )的直系同源物。

2023年2月6日，中国科学院生物物理研究所王艳丽及孙伟共同通讯在Nucleic Acids Research 上在线发表题为“Anti-CRISPR AcrIIC5 is a dsDNA mimic that inhibits type II-C Cas9 effectors by blocking PAM recognition”的研究论文，该研究解析了AcrⅡC5与Nme1Cas9和sg RNA的复合物结构，发现AcrIIC5采用一种新颖的折叠方式来模拟双链DNA的大小和电荷分布，并利用其带负电的沟来结合和封闭Cas9靶DNA缺口中的PAM结合位点。

AcrIIC5定位于Cas9的WED和PI结构域之间的缝隙中，抗CRISPR的一端与磷酸锁环和RuvC与BH结构域之间的连接子相互作用。该研究使用生化和突变分析来建立AcrIIC5的作用机制模型，并确定了抗CRISPR和Cas9上对它们的相互作用和抑制都很重要的残基。总之，AcrIIC5的结构和机制揭示了不同的抗CRISPR蛋白之间的趋同进化，这些抗CRISPR蛋白使用DNA模拟策略来抑制不同的CRISPR - Cas监视复合物，并为有效抑制II - C型Cas9同源物提供了新的见解。

CRISPR - Cas系统是细菌和古细菌抵御细菌病毒(噬菌体)和其他可移动遗传元件( MGEs )的适应性免疫系统。CRISPR - Cas系统从入侵的DNA中捕获DNA片段，并将其作为新的间隔序列整合到CRISPR阵列中。CRISPR阵列被转录并加工成成熟的CRISPR RNAs ( cr RNAs )，指导CRISPR相关( CRISPR-associated，Cas )蛋白的监视复合体切割外源核酸。CRISPR - Cas系统被分为两大类六类：I类(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型)包括具有多亚基监测的系统，II类系统(Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型)由单个效应蛋白组成，包括研究较多的II型Cas9效应蛋白。

为了逃避宿主细菌中CRISPR - Cas系统的威胁，一些噬菌体和其他MGEs编码抗CRISPR ( Acr )蛋白。Acrs利用各种机制抑制CRISPR - Cas系统，如阻碍cr RNA装载，阻止靶DNA或RNA结合，抑制核酸酶结构域的活性位点，或阻断激活监视复合物的切割活性状态所需的构象变化。

尽管Cas9和其他基于CRISPR的基因编辑工具得到了广泛和成功的应用，但非期望的脱靶切割仍然是一个挑战。因此，许多高保真度的Cas蛋白变体被设计用于解决这一问题，其中从细菌系统中鉴定出的新的直系同源物可以产生一些具有天然高保真度的新候选者，包括Cas9的II - C分支中的许多酶。在已知的Ⅱ- C型Cas9直系同源基因中，来自脑膜炎奈瑟菌的2个旁系同源基因Nme1Cas9和Nme2Cas9已经在人类细胞中进行了基因组工程验证。

Nme1Cas9-sgRNA-AcrIIC5三元复合物的冷冻电镜结构（图源自Nucleic Acids Research ）

Acrs提供了一种控制CRISPR - Cas活性的替代方法，因此有望减少由于细胞中Cas蛋白活性过高或延长而导致的脱靶编辑。此外，Acr抑制机制可以帮助我们更好地理解CRISPR - Cas激活的构象变化和结构阶段，通过捕获不同状态的效应物和提供试剂来特异性阻断Cas蛋白的特定生化活性。

目前已知有5种Acrs( AcrⅡC1-AcrⅡC5 ) 可以抑制该高保真Ⅱ- C型Cas9酶，其中3种的作用机制已经被阐明。AcrⅡC1与HNH核酸酶结构域中的催化位点结合，并掩盖RuvC结构域，阻止靶DNA切割。AcrⅡC2与带正电的BH结构域结合，阻止向导RNA的装载，从而阻断监视复合物组装。两个AcrIIC3蛋白通过与HNH和REC2结构域相互作用将两个Cas9蛋白连接在一起，从而降低HNH结构域的流动性，从而阻止Cas9的激活。据报道，AcrⅡC5是最有效的Ⅱ- C型Cas9抑制剂，但其作用机制和结构仍不清楚。该Acr可以抑制西蒙斯菌属muelleri ( Smu Cas9 )、副流感嗜血菌( Hpa Cas9 )和Nme1 Cas9的II - C型效应子，而非与之密切相关的Nme2Cas9。

该研究确定了AcrⅡC5与Nme1Cas9 - sgRNA复合物结合的冷冻电子显微镜( Cryo-EM )结构，并进行了突变和生化分析以确定其机制。该研究发现AcrIIC5只与sgRNA结合的Nme1Cas9监控复合物结合，而不与apo - Nme1Cas9结合。AcrⅡC5的球状结构具有与双链DNA ( ds DNA )片段相似的尺寸、形状和电荷分布。结构分析揭示了AcrIIC5结合在Cas9的WED和PI结构域之间的裂隙中，占据了目标DNA的双链相邻基序( PAM )结合的位点。AcrⅡC5不能抑制Nme2Cas9旁系同源基因，可能是因为Nme2Cas9的磷酸锁环序列与Nme1Cas9和SmuCas9相比发生了细微的变化。总之，该结果明确了一个强效的抗CRISPR ds DNA模拟物的结构和机制，并表明逃避Acr结合可能驱动Cas蛋白的进化。

参考信息：https://doi.org/10.1093/nar/gkad052

本文转载自公众号“iNature”

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原标题：《【科技前沿】中国科学院王艳丽/孙伟发现一种新的dsDNA模拟物，通过阻断PAM识别抑制Cas9》

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