下载客户端

Nature子刊：张恒/邓增钦合作解析细菌新型CRISPR抗病毒系统工作机制

2022-11-01 06:30

来源：澎湃新闻·澎湃号·湃客

III-E型CRISPR-Cas系统使用一个称为Cas7-11（也称为gRAMP）的单一多域效应器来切割RNA并与caspase样蛋白酶Csx29相结合，显示出RNA靶向应用的良好潜力。III-E型CRISPR-Cas系统的结构和分子机制尚不清楚。

2022年10月27日，天津医科大学张恒团队联合中国科学院武汉病毒所邓增钦团队在 Nature Microbiology 期刊发表了题为：Structure and function of a bacterial type III-E CRISPR–Cas7-11 complex 的研究论文。

该研究通过解析Cas7-11复合物不同状态的冷冻电镜结构，利用大量生化实验阐明了Cas7-11加工前体CRISPR RNA（pre-crRNA），识别和切割target RNA的机制。研究还发现Cas7-11识别target RNA后，能够引起Csx29的构象变化，很可能激活其蛋白酶活性发挥免疫功能。

CRISPR-Cas系统是细菌和古菌抵抗可移动遗传原件入侵的适应性免疫系统，可以将其分为两类，第1类：由多个效应蛋白组成的蛋白复合物行使功能，包括 I，III和IV型；第2类由单个效应蛋白行使功能，包括II，V和VI型。最近研究人员鉴定了一种新型III-E亚型CRISPR-Cas系统。该系统在哺乳动物细胞进行RNA打靶时具有较高的活性及较低的毒性。

不同于之前发现的多亚基III型系统，它由4个Cas7和1个Cas11结构域融合形成一个大的效应蛋白Cas7-11/gRAMP，在crRNA指引下对靶标RNA进行切割。Cas7-11能与一种Caspase-like蛋白酶（Csx29/ TPR-CHAT）相互作用（ref 3），形成由CRISPR引导的Caspase复合物(Craspase)，因此该系统可能同时兼具核酸酶与蛋白酶活性，暗示着一种新型抵抗噬菌体侵染的机制。

在这项最新研究中，作者首先借助冷冻电镜解析了Candidatus ‘Scalindua brodae’ 菌株的Cas7-11-crRNA（SbCas7-11-crRNA）二元复合物结构，发现Cas7-11由四个结构相似的Cas7以及一个Cas11和一个IPD结构域组成（图1）。IPD是一段位于Cas7.4中间的插入序列，目前对其结构与功能的研究尚不清楚。然而作者将IPD删除之后，并未影响target RNA的识别和切割，提示可以通过将IPD删除构建小型化的基因编辑工具。

图1 III-E型CRISPR-Cas系统的基因结构

在传统的III型CRISPR-Cas系统中，Cas6蛋白负责pre-crRNA加工成熟，而Cas7-11蛋白本身就具有相应的pre-crRNA加工能力。Cas7-11–crRNA结构显示成熟后的crRNA的重复序列结合在Cas7.1结构域，因此推测Cas7.1结构域可能具有加工pre-crRNA的能力。接下来作者设计了一系列突变实验来寻找Cas7.1的活性位点。由于单体SbCas7-11不稳定，作者选用来自Desulfonema ishimotonii物种的同源蛋白DiCas7-11进行实验。结果表明DiCas7-11的4个突变体（W20A、R26A、H43A和Y55A）都能够明显阻碍pre-crRNA的加工（图2），证明了Cas7.1结构域在pre-crRNA切割中的重要作用。其中W20和R26在Cas7-11同源物中严格保守，但H43被SbCas7-11中的苏氨酸残基（T45）取代，Y55被苯丙氨酸残基（F57）取代。

图2 野生型（WT）和突变型DiCas7-11蛋白的体外pre-crRNA切割实验。括号中为SbCas7-11对应残基（绿色）

Cas7-11有两个target RNA切割位点，间隔6个核苷酸，称为位点1和位点2。Cas7-11-crRNA-target RNA三元复合物结构发现crRNA序列中的两个核苷酸，4A和10U，分别被Cas7.2和Cas7.3结构域的β-指结构翻转，提示target RNA切割很可能发生在这两个位点附近。在III-A/B系统中，Csm3/Cmr4亚基通过催化loop中的一个保守天冬氨酸残基发挥RNase活性。作者通过对比SbCas7-11和Csm复合物的结构，发现在Cas7.3中存在一个对应的保守的天冬氨酸残基（D698）。与预期的一样，D698A突变几乎消除了2位点的target RNA切割（图3左）。然而，在Cas7.2中的对应位置包含一个非保守的丝氨酸残基（S457），并且S457A突变对1位点的切割影响不大。

有趣的是，在同一催化口袋中的酸性残基D547的突变，几乎消除了SbCas7-11在1位点的切割活性（图3中）。更有趣的是，序列比对显示，在大多数Cas7-11同源物中，这两个相应位置上一般只会出现一个酸性氨基酸。例如，SbCas7-11有S457-D547，而DiCas7-11在对应的位置上是D429-N518。因此，作者提出了在这两个位置上的氨基酸可能存在功能冗余的假设，并做了功能丧失和功能获得突变来验证这一假设。与预期的一样，结果表明Cas7.2催化口袋的这两个活性位点酸性残基可能在功能上是等价的：两个位置的任何一个天冬氨酸残基都可以对target RNA进行切割（图3右）。

图3 左，Cas7.3结构域突变的体外target RNA切割。中， Cas7.2结构域突变的体外target RNA切割。右， Cas7-11同源物的序列比对

为了研究Cas7-11如何调控Csx29的机制，作者解析了Cas7-11-crRNA-Csx29三元复合物和Cas7-11-crRNA-target RNA-Csx29四元复合物的电镜结构。结构揭示Csx29在target RNA的存在下发生了明显的构象变化：TPR区域靠近Cas7-11，而蛋白酶PS结构域远离Cas7-11，使得Csx29的两个催化残基H585和C627在空间上更加靠近，暴露出其催化口袋（图4）。因此，target RNA的结合很可能可以激发Csx29蛋白酶活性，从而与Cas7-11协同抵抗外源核酸的入侵。该团队关于Csx29蛋白酶活性的测定及切割底物的鉴定等后续工作也证实了这一推断（该部分研究工作正在under revision）。

图4 Csx29未结合target RNA和结合target RNA时的构象变化

该研究阐述了Cas7-11加工成熟pre-crRNA和切割target RNA的机制，以及Cas7-11对Csx29活性的调控机制（图5）。该研究极大地促进了人们对于CRISPR系统的理解，并为Cas7-11作为安全高效靶向RNA编辑工具的工程化改造提供了结构基础。同时该系统所具有的RNA指导的蛋白酶活性可能为生命科学研究带来新的视角和新的工具。