细胞“物流系统”如何调控？中美联手借冷冻电镜开启解码之路

真核生物细胞内蛋白质、脂类等“大型货物”的运输，被生物膜这道屏障天然阻隔。上个世纪60年代，科学家开始认识到细胞内存在一套有条不紊的“物流系统”，即囊泡转运。作为细胞生命活动的基本过程，囊泡转运很快成为诺贝尔奖热门领域，1974年至今已累计五次与之相关。

“但是到今天为止，细胞内囊泡的功能、分选和转运的过程、动态调控的过程等，仍然还有很多未解之谜。对囊泡的一系列研究仍然是现代细胞生物学很重要的热点，很多新的发现也还在不断地被做出来。”清华大学生命科学学院院长王宏伟教授在接受澎湃新闻（www.thepaper.cn）采访时如此评价复杂而又精细的囊泡转运过程。

北京时间1月16日凌晨，王宏伟作为通讯作者的一篇最新成果发表在国际顶级学术期刊《自然》（Nature）子刊《自然-结构与分子生物学》（Nature Structural & Molecular Biology）。这一最新成果正是和囊泡转运有关，研究团队解析了该过程中一种重要蛋白复合体Exocyst的结构及其装配方式，平均分辨率为4.4埃（Å），同时提出了一种囊泡锚定细胞膜的调控假说。

该论文的另一通讯作者宾夕法尼亚大学文理学院生物学系教授郭巍对澎湃新闻（www.thepaper.cn）表示，“Exocyst 复合体是控制分泌囊泡锚定到细胞质膜的一个蛋白八聚体。它通过不同亚基与囊泡和细胞质膜的分别作用，把囊泡栓系到细胞质膜，并促进其融合，这个过程最终使囊泡转运的货物如蛋白质和磷脂等融合到细胞质膜上或分泌到细胞外，从而影响一系列的细胞活动，包括细胞极性的建立、细胞生长、细胞间通讯等。”

郭巍还表示 “Exocyst只是多亚基系连复合体中的一种，这次近原子分辨率的结构解析和模型搭建不仅对于我们理解分泌囊泡与细胞膜之间的栓系机制有重要意义，也对其他细胞内膜系统间的囊泡转运和锚定机制提供了重要信息。”

据王宏伟介绍，该项研究工作前后历时三年，主要参与人员还包括宾夕法尼亚大学的博士后梅坤荣、清华大学的博士研究生黎艳等人。另外，北京生命科学研究所高级研究员董梦秋和她领导的小组也做出了关键的技术贡献。

未知的“拉近”过程

所谓的囊泡是由单层膜形成的闭合结构，大小从几十纳米到数百纳米不等，主要负责细胞内由膜包被的不同细胞器之间的物质运输、信息传递等。

囊泡能够以出芽的方式脱离转运起点，以膜融合的方式进入转运终点。由包裹“大型货物”的囊泡、转运复合体、动力蛋白、微管、肌动蛋白纤维和调节分子等参与的过程通常被形象地称为细胞内的“物流系统”。

其中，在囊泡和细胞膜实现融合之前，囊泡需要被特定的分子机制识别并拉拢靠近细胞质膜，这一被“拉近”的过程即为“锚定”。

王宏伟介绍，“在分泌囊泡装运过程中，囊泡被动力蛋白通过微管和肌动蛋白纤维运输到细胞膜附近，然后通过一定的分子机制融合到细胞质膜上，从而把其中运输的物质吐到细胞膜上或细胞外。在SNARE介导膜融合之前，分泌囊泡需要锚定到细胞质膜的内侧，Exocyst复合体在这个锚定的过程中发挥非常关键的作用。”

Exocyst复合体是多亚基系连蛋白复合物（MTCs）的一种。多亚基系连蛋白复合物主要负责将细胞内的运输囊泡捕获至特定的靶膜，随后发生膜融合。Exocyst复合物首先是在酿酒酵母中被分离发现，包含Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70和 Exo84八个亚基。

实际上，在王宏伟及其合作团队此番工作之前，也有其他学者致力于多亚基蛋白复合物的结构解析。

王宏伟表示，“对于多亚基系连蛋白复合物，在过去的二十年里，大家通过各种结构生物学手段和技术来研究它们，希望能了解该类复合体发挥功能的分子机制。比较早期的时候，研究人员利用低分辨率的电子显微镜来获得复合体大致的形状，也有一些团队把某些蛋白质亚基的一小部分取出来，利用X射线晶体学的技术来解析它们的结构。最近随着电子显微镜技术的发展，虽然不断的有团队报道这类复合体的二维结构，其完整的三维结构却一直未被破解。”

“然而，对于阐释机制更关键的一点，也就是Exocyst的八个蛋白质亚基如何装配到一起，以及如何实现锚定，这些都还是不清楚。”王宏伟称，“我们这项研究用单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）和化学交联质谱技术（CXMS）相结合搭建了该复合体的大致原子模型，是首次看到它的八个亚基如何装配成整个复合体，从而实现分泌囊泡和细胞质膜之间的锚定。”

配对“拉链”和关键的Sec3

首次解析出来的Exocyst复合体的八个亚基究竟如何实现装配？

“每两个蛋白亚基会通过一个类似“拉链”的结构联成一对；每两对之间又形成一个四股螺旋束，形成一个层级式的装配方式。最后分别由四个亚基组成的亚复合体 I 和 亚复合体 II像两个手掌一样合起来形成了八个亚基的完整复合体。”

王宏伟提到，在所有的八个蛋白质亚基中，关键在于Sec3蛋白。

“一些生化试验已经表明，Sec3可能是一个结合到细胞质膜上的蛋白，剩下的七个蛋白位于囊泡上面，Sec3和其它七个蛋白之间存在特异性的识别并进行装配。在这个识别、装配的过程当中，囊泡就被“拉到”了细胞质膜表面。”

王宏伟强调，“这是根据我们解析出的结构所提出的一种假说，针对这个假说我们用酵母细胞做了一系列体内的功能实验来验证，实验结果与我们的假说是一致的。”

当然，在王宏伟及其研究团队眼中，这一最新搭建出的模型还不能称得上是一个精细的模型。“这项研究工作只是刚刚开始。”王宏伟提到，“我们会进一步精修，比如通过进一步提高我们复合体解析的分辨率把它的细节看得更清楚。”

研究团队还致力于更加“整体”和“动态”。“我们真正希望看到的是，Exocyst复合体在整个囊泡转运过程中的不同阶段，它和囊泡的相互作用、和细胞质膜的相互作用，以及在锚定过程中受到其它蛋白调控后不同的状态。在不同情况下它的结构变化对于我们深入理解囊泡与细胞质膜的锚定过程、进一步融合的过程会提供更大的启示。”