导管中表达Ngn3的祖细胞在胰腺成体细胞新生中的作用

原创 医学参考报 干就有未来

撰文│杨 勇 何志颖

编辑│李佳潞

审校│汤红明

【据《Cell Stem Cell》2021年9月报道】题：导管中表达Ngn3的祖细胞在胰腺成体细胞新生中的作用（英国弗朗西斯·克里克研究所作者Christopher Gribben等）

全球每11个人中就有1人罹患糖尿病，而β-细胞的缺失与1型和晚期2型糖尿病密切相关。β细胞群一度被认为主要通过增殖来维持，然而，陆续有证据表明，在成年小鼠受损的胰腺中存在非β细胞来源的β细胞新生。目前，对内分泌祖细胞在成熟胰腺内环境稳定中的存在及意义仍有争议。

有研究发现，发育的胰腺内分泌祖细胞表达的关键转录因子Ngn3与成熟β细胞新生密切相关。导管细胞被认为是成熟Ngn3+细胞的来源。然而，谱系追踪研究对导管细胞在稳态和损伤模式下生成β细胞的能力产生了相互矛盾的证据。这些相互矛盾结果不容忽视的原因之一在于技术，用于驱动导管细胞差异表达的Cre启动子及示踪剂的重组效率均会导致标记效率的巨大差异。此外，追踪标记细胞的持续时间变化很大。因此，尽管有一些证据表明成熟导管衍生的内分泌分化，但其作用和意义尚不清楚。

基于此，作者所在课题组利用谱系追踪、3D成像和单细胞RNA测序，发现了一类驻留在导管中的SST+（生长抑素阳性）内分泌祖细胞群是内稳态和糖尿病β细胞新生的来源，揭示了除β细胞增殖外维持成熟胰岛β细胞群的新机制。

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为了能随时间的推移追踪INS+（分泌胰岛素）细胞，本文研究人员首先将Ins1-CreERT系与敏感型谱系示踪R26-CAG-TdTomato小鼠杂交，在他莫昔芬给药后1个月和6个月对成年小鼠进行分析，通过抗体染色、扫描和自动定量分析胰腺，以确定追踪的胰岛β细胞的百分比。结果观察到随着时间推移，胰岛β细胞百分比下降，并且在胰岛外（导管内）发现示踪的INS+/UCN3-细胞（UCN3是成熟β细胞的标志物），提示这些导管内驻留的INS+细胞不成熟，随着时间推移，可能有助于β细胞群的形成。

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然后，研究人员利用Hnf1b-CreERT; R26-CAG-TdTomato杂交小鼠示踪胰腺导管细胞，他莫昔芬给药后观察到94%的导管细胞及δ细胞（SST+）被标记。他莫昔芬治疗后1周、5周和12周对胰岛进行分析发现，从第5周到第12周，示踪的胰岛（INS+）细胞百分比显著增加，δ细胞（SST+）急剧减少，且在12周内，每周增加的示踪胰岛细胞（INS+）细胞速率（0.66%）与上述Ins1-CreERT、R26-CAG-TdTomato杂交小鼠实验中的胰岛β细胞减少（0.68%）非常相似，由此进一步表明，随着时间推移，Hnf1b示踪的细胞会大量进入胰岛，从而有助于维持β细胞群。

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接下来作者认为如果导管细胞转化为β细胞，Ngn3的表达将必不可少。因此，为分析Ngn3+细胞的分化潜力和后代，作者构建了Ngn3-CreERT、R26-CAG-tdTomato小鼠，并在他莫昔芬注射后1周、4周和12周三个时间点进行观测，导管和胰岛中都观察到Ngn3示踪的细胞，并且表达内分泌（INS和SST）标记基因。对抗体染色的胰腺器官进行FLASH三维成像发现示踪细胞位于导管外和胰岛。

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为进一步研究Ngn3+导管细胞在糖尿病中的重要性，作者构建了Ngn3-CreERT、R26-CAG-TdTomato、AKITA小鼠，观察到在Tamoxifen给药后，该小鼠导管中追踪到Ngn3+导管细胞的INS+或SST+的细胞大量增加。在AKITA糖尿病小鼠的背景下使Ngn3的一个等位基因失活，结果发现敲除Ngn3的AKITA糖尿病小鼠可使小鼠表型恶化，平均血糖水平显著提升。

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最后，为继续分析具有分化能力的Ngn3+/SST+细胞群，作者从给药10天后的Ngn3-CreERT、R26-CAG-tdTomato小鼠身上分离出胰岛进行了10XscRNA-seq。最终得到21813个细胞，降维和聚类分析后发现几个明显的细胞类型，根据细胞标记基因对细胞群体进行注释。观察Ngn3+细胞和TdTomato+细胞的分布，发现Ngn3+细胞大多出现在δ细胞中，TdTomato主要在成熟的β细胞中表达。进一步分析发现Ngn3+和tdTomato+细胞中各种胰岛细胞类型标记基因的表达，发现两组细胞表现出显著不同特征，发现Hnf1b和Sox9在一些Ngn3+和tdTomato+细胞中表达，提示导管细胞起源。Ngn3+/tdTomato+细胞的拟时序分析发现Ngn3+细胞（起始状态）产生SST+细胞，SST+细胞后续分化成INS+细胞。

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通过这项研究，作者发现Ngn3+导管前体细胞是成体β细胞新生的来源。然而这些SST+导管内分泌前体细胞仍然没有特征性，需进一步描述这些细胞特征。

（ID：yxckbsc2022020701）

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《医学参考报》干细胞与再生医学专刊

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