Cell | 蒲慕明发表灵长类大脑的单细胞转录组、连接组和神经调控的文章

单细胞转录组分析促进了大脑中的细胞类型鉴别和细胞类型特异性连接组的绘制，有助于阐明大脑功能的神经回路并通过神经调控治疗大脑疾病。然而，我们缺乏对神经元类型/亚型有共识的定义，也缺乏复杂互连网络中因果关系的明确理解。

2022年6月21日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑技术中心蒲慕明在Cell发表题为“Transcriptome, connectome and neuromodulation of the primate brain”的评论文章，该文章重点关注灵长类动物大脑的单细胞转录组学和连接组学研究，以及通过物理手段进行精确的神经调控，旨在调控各种大脑功能和功能障碍背后的特定神经回路。

自从 Ramon y Cajal 提出神经元作为神经系统的基本单位以来，识别所有神经元类型并绘制它们在大脑中的连接图谱一直是神经生物学家迫在眉睫的任务。基于细胞形态、电生理特性、基因表达谱和连接模式对细胞类型进行分类的多种方法已经产生了大量信息。单细胞 RNA 测序技术的最新进展极大地加快了基于转录组的细胞分类的步伐。细胞类型特异性病毒载体和光学成像技术的出现还允许绘制介观神经连接组（mesoscopic connectomes），包括轴突全脑的投射模式（“投射组”）和单个神经元所接收的所有输入神经连接（“输入组”）。在基于转录组和基于连接组的分类中，细胞类型的数量随着分析的分辨率而增加，因此最终每个细胞都可能成为自成一类。这就需要我们对定义细胞类型和亚型的标准达成共识，最好是一种可以整合各种分类方案所获信息的标准。

尽管目前尚未就细胞分型标准达成共识，但在过去十年中，在研究小鼠大脑的单细胞转录组和连接组以及来自表观基因组、生理和行为研究的信息方面已经取得了巨大进展。科学家们正在努力将单细胞转录组学研究从小鼠扩展到非人类灵长类动物 (Non-human primate, NHP) 和人类大脑。然而，在 NHP 中绘制单细胞连接组仍处于早期阶段。本评论重点关注灵长类动物大脑的单细胞转录组学和连接组学研究，以及通过物理手段进行精确的神经调控，旨在调控各种大脑功能和功能障碍背后的特定神经回路的活动。

灵长类大脑的单细胞转录组

现在正在从 NHP 和人类大脑中获得有关单细胞转录组的大量数据。在胚胎和成年小鼠和人类大脑的同源区域中发现了保守和差异的基因表达模式。与小鼠一样，需要整合灵长类动物大脑中形态、电生理特性和基因表达模式的单细胞数据。针对于人类皮层内的谷氨酸能神经元，Berg 等人确实发现了它们的转录组模式和形态以及生理特性之间的一些对应关系。随着这项工作的进一步进展，我们越来越需要统一定义细胞类型和亚型，这可以作为整合各种分类方法所获信息的基础。

一种神经元类型或亚型应该有一些独特的特征为标志， 而这些特征在整个神经元的整个生命周期中都必须相对稳定；而在短时间尺度上持续的基因表达、生理特性和形态/连接性的变化可以被认为是神经元的不同状态。鉴定稳定且独特表达的基因将有助于定义细胞类型，但迄今大多数单细胞转录组的分析一般都缺少有关转录组模式的时间变化的信息。已知在早期神经发生过程中不同转录因子组的表达决定了主要神经元类型的命运，即谷氨酸能神经元、GABA能神经元和调质神经元。通过对祖细胞进行并行标记以跟踪小鼠前脑发育过程中的谱系关系和转录组特征，Bandler 等人2022 年发现皮质 GABA 能亚型的分化是在祖细胞水平的就可以表现出不同。目前尚不清楚每种主要神经元类型的祖细胞群内的异质性在多大程度上可以解释其后代的亚型多样化，以及内在的谱系依赖性规则是否在决定不同大脑区域的所有神经元亚型中起主导作用。

我们可以合理地预期，分化的神经元亚型的稳定基因表达模式与其在神经网络中的功能要求应该相匹配，而通常神经元的功能常是由其特定的连接性来决定的，并且匹配过程始于有丝分裂后神经元迁移到大脑中的指定位点并形成突触连接。Shibata 等人2021 年在发育中的小鼠大脑中发现了视黄酸的前后脑区的梯度及其匹配受体的表达，并且视黄酸活性是建立丘脑皮质连接所必需的。因此，早期神经发生过程中时空编程的基因表达可能不但决定了有丝分裂后神经元（Fishell 和 Heinz 所命名）的“基态”-定义了主要神经元类型, 而且也指导了神经元迁移、轴突/树突生长和树枝状化，以及初始神经元连接性。随后与局部环境的相互作用以及依赖于电活动的神经连接的修剪和巩固化，会赋予其独特形态和生理特征的神经元亚型的稳定基因表达的最终模式。因此，可以整合基于转录组和基于连接组的亚型分类的一种方式，就是在每种类型的神经元中发现一组独特的、稳定表达的基因，同时这些神经元也表现出独特的连接组模式。在灵长类动物新皮质中，鉴于其祖细胞的长期增殖和更复杂的细胞间相互作用和连接性，人们预计会出现比啮齿动物更多的神经元亚型。此外，基于稳定性的神经元类型/亚型分类标准必须能应用于经验带来的长期记忆，因为这些记忆涉及长期稳定的基因表达和突触连接的改变。长期记忆，特别是那些潜在的灵长类大脑高级认知功能，如面部识别和语言处理，是否涉及创建不同的神经元亚型？

空间转录组分析的快速发展现在允许以单细胞分辨率绘制整个大脑的基因表达空间分布图。大规模“stereo-Seq”技术现已应用于整个猕猴大脑，以确定皮层和皮层下大脑区域中各种以转录组模式定义的细胞类型的空间分布。这种空间转录组学分析也将有应用于手术获得或尸检的人脑组织，并提供更精确的特定基因表达的空间定位，这些信息理解人脑各种功能和功能障碍的基础。结合组织学和基于 MRI 的信息，空间转录组学分析还可以帮助产生更精细的脑区分割，为绘制灵长类大脑中所有神经元类型的神经连接图谱提供基础。

在动物的整个生命周期中纵向进行的空间转录组分析代表了一个很有意义的新研究方向，这将使我们能够解决有关灵长类动物大脑进化、发育和衰老的许多重要问题。为了回答这些问题，我们不仅需要鉴别在灵长类动物中特异表达的基因，还需要了解灵长类特异性的基因表达调控元件，这些元件决定了保守基因和灵长类特异性基因的独特表达模式，以及它们对组织环境中细胞间相互作用和表观遗传因素的依赖性。人类大脑发育期延长、皮层褶皱的形态发生以及人类特定功能（例如语言）的复杂网络的形成，可以极大地受益于特定基因何时、何地以及如何表达的知识。其中一些问题可以通过将转基因和基因编辑技术应用于 NHP 来解决。

灵长类动物大脑的介观连接组

虽然人脑的单细胞转录组分析可以在手术中获取的样本和尸检组织上进行，但人脑介观连接组的映射要困难得多，在活的人脑组织中进行细胞类型特异性探针的病毒表达以追踪神经元连接，以及高通量成像和在单细胞分辨率下大规模重建远程投射，都有极大的困难。NHP 中的介观神经连接组的绘制，例如狨猴和猕猴，目前较为现实。最近通过重建整个大脑超薄切片的荧光显微图像，或改良的光学透明组织块的光片成像，已经证实了猕猴大脑在微米分辨率下远程跟踪单个神经元投射的能力。每个猕猴大脑的数据采集和处理工作量巨大，但似乎在一个可行的范围内。另一方面，阐明不同大脑区域内的局部网络连接，绘制每种类型神经元的输入组，是更艰巨的挑战。

以往的解剖学工作已经使用逆行荧光珠对猕猴大脑中的皮质-皮质投射进行了广泛的研究。鉴定在 NHPs 的不同皮层区和大脑各区域内不同细胞类型中差异表达的基因，以及进一步阐明表达这些基因的特定的启动子/增强子，将导致开发用于绘制细胞类型特异性神经连接组的分子示踪剂。这种连接组信息为进一步研究与不同大脑功能相关的神经元/回路特异性活动提供了基础。宏观脑成像（例如，磁共振成像、MRI）已经在 NHP、正常人类受试者和脑部疾病患者中以毫米分辨率生成了有关结构和功能连接性的大量信息。相对较低的空间和时间分辨率、图像收集和分析程序的变化以及个体差异性限制了这些成像数据在临床环境中的有用性。NHP 大脑的介观连接组分析，结合先前对同一动物的结构和 fMRI 成像，将有助于解释从扩散张量成像推断出的宏观“结构连接组”。对特定大脑区域中特定神经元类型活动的光学成像和光遗传学操作将进一步有助于解释 MRI 研究推断的“功能连接组”。

用于治疗脑部疾病的神经调节

单细胞转录组和连接组分析的普遍目标是为监测和操纵特定神经元类型和回路的活动提供基础。然而，大脑疾病特异性神经元和回路难以识别，特别是对于自闭症、抑郁症和精神分裂症等精神类疾病，这些疾病涉及随个体遗传背景和发育史而变化的网络异常。在相互连接的神经网络中，特别是在关联和额叶皮质中的神经网络中，很难破译多个大脑区域相关活动之间的因果关系，也很难确定神经回路是在主导还是仅仅调节特定的大脑功能。此外，异常的神经回路源于神经元的异常连接，而这些神经元也包含在许多其他正常回路连接之中，因此靶向分子和细胞信号转导的药物必然具有非特异性回路作用。人们越来越希望通过物理、生理和心理手段调节功能失调的网络（这里称为“神经调控（neuromodulation）”）可以提供脑部疾病的非药物治疗。

药物或神经调控方法的开发需要更合适的动物模型。迄今为止，一般是使用脑疾病的啮齿动物模型对候选药物进行临床前疗效测试， 但最终能通过临床试验的药物很少。由于 NHP 在许多解剖学和生理学特征上与人类接近，使用狨猴和猕猴的疾病模型可能被证明是有价值且不可替代的。许多非侵入性神经调控工具，例如经颅磁刺激 (TMS)、直接或交流电刺激 (tDCS 或 tACS) 和超声刺激具有较低的空间分辨率和较差的目标特异性，这一问题可以通过使用较大尺寸的 NHP 大脑来部分解决。用于制作小鼠模型的转基因和基因编辑方法现在正在扩展到 NHP。最近的一个例子是通过删除猕猴胚胎中的核心昼夜节律基因 BMAL1 产生的昼夜节律紊乱的猕猴模型。这些 BMAL1 缺失的猴子表现出多种症状，包括睡眠障碍、焦虑/抑郁样行为和精神分裂症样脑电图特征，目前正被用于测试药物和神经调节治疗缓解特定精神疾病症状的功效。

理想情况下，使用神经调控的临床治疗应该基于对特定脑部疾病的特定功能障碍神经元和回路的了解，目前这种情况在很大程度上是无法实现的。从另一方面来说，即使不知道大脑疾病的“原因”，也可以使用神经调控来纠正“影响”（可观察到的疾病表型），前提是原因和影响可能在复杂的神经网络中互为因果。例如，基于观察到阿尔茨海默病 (AD) 小鼠模型中的伽马振荡减少，Martorell 等人2019 年实验表明，通过视觉或听觉刺激诱导伽马振荡可以减少整个新皮层的淀粉样蛋白斑块并改善记忆功能。

使用侵入性（例如，深部脑刺激，DBS）和非侵入性（例如，tDCS 和 TMS）方法的临床神经调控研究表明，患者的治疗效果存在很大差异，正如几项关于 tDCS 治疗中风患者运动缺陷的荟萃分析所表明的那样。这种可变性可归因于各种研究中使用的参数的差异，例如强度、时间、持续时间和调控部位，以及患者特定的颅骨解剖和神经回路差异。在神经调控的临床应用中，调kong时机的重要性尚未得到足够的重视。最近对猕猴中风模型的一项研究表明，低频硬膜外交流电刺激 (ACS) 会导致病灶周围皮层中与任务相关的神经元集群发生同步放电，从而提高了猴子在中风后的抓握灵活性。这可归因于在抓握运动同时施加的 ACS 增强了抓握运动的神经回路。因此，当与患者发起或治疗触发的目标行为激活同时进行时，相对非特异性的神经调控可能会增强治疗效果，即使确切的潜在神经回路仍然不清楚。

考虑到颅骨解剖结构和神经回路配置的个体差异，需要对每个受试者大脑的影响进行定量模拟或测量，以实现更精确和有效的神经调制。例如，将临床反应映射到一系列焦点刺激可以帮助确定在使用 DBS 治疗严重抑郁症时有效的个性化刺激参数。在非侵入性 tCS 和 TMS 治疗中，基于结构 MRI 数据的颅内电场分布的个体特异性建模可以更精确地识别电流幅度和调控的大脑区域，基于 EEG 的脑电微状态分析可以提供调控所诱导的、在线监测的大脑网络的动态变化。用计算建模辅助校准刺激参数，以及基于调控引起的大脑状态变化或个体患者的即时临床反应, 在线式的调整参数，可以为治疗脑部疾病提供有效的精确神经调控。

来源：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）

原标题：《Cell | 蒲慕明发表灵长类大脑的单细胞转录组、连接组和神经调控的文章》