中山大学Chem：一种新型的蛋白质氢键杂交框架

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Physical science

自下而上地将模块单元组装成具有所需功能的超级结构是一个异常活跃的研究领域。实际上，这种组装过程在生命系统中广泛存在，例如，蛋白质可组装成动态聚合物（肌动蛋白、微管蛋白等）、多维结构（细菌s层、胶原蛋白等）及完整的晶体（如质多角体病毒多面体）等更高阶的结构，以执行特定的生物功能。在过去的几十年时间里，科学家们已经在模仿这种生物组装过程，致力于构建具有特定功能的蛋白质纳米材料。基于金属配位诱导和可编程DNA-DNA配对驱动的蛋白质组装技术已初步实现蛋白质纳米结构的可控设计。然而，目前这些技术仍难以推广到不同的蛋白质单元，这是因为蛋白质表面化学的异质性会导致组装位点的难以控制。截至目前，只有极少数蛋白质可以通过上述技术组装出明确结构的材料体素，大大限制了这类材料的功能多样性。

有鉴于此，中山大学研究团队报道一种新的蛋白质导向的氢键组装策略。在该组装过程中，蛋白质“模块”通过表面丰富的氢键作用位点（氨基酸残基）自发锚定有机配体，并借助有机配体间的强π-π作用定向组装，形成高度结晶的氢键生物杂交框架（Hydrogen-bonded biohybrid framework, HBF）。低电子剂量冷冻电镜技术在单分子水平上剖析了HBF的晶体学结构，并证明蛋白质在晶体框架中的单分散性。框架的蛋白质含量最高可达67.4%（W/W），是目前报道的最高数值。此外，得到的框架结构具有超高的生物活性和稳定性，其孔道结构和蛋白质的限制程度(松弛到紧密)可通过调节配体性质进行调控。这种通用的组装策略可将脆弱的生物大分子和有机小分子合理地组装成稳健的材料体素，为纳米蛋白质超级结构的构筑提供了新思路，在生物传感、催化、蛋白质递送和生物医药等领域均具有广泛的应用前景。该研究成果以“Protein-directed, hydrogen-bonded biohybrid framework”为题发表在Cell Press化学旗舰刊物Chem上。文章的第一作者是中山大学化学学院陈国胜副教授和孙逸仙纪念医院黄思铭助理研究员，通讯作者是中山大学化学学院欧阳钢锋教授。

蛋白质导向的氢键杂交框架的设计及表征

首先，研究人员通过系统表征手段证实蛋白质可通过表面丰富的氢键作用位点锚定有机配体，并触发杂交框架的定向组装。低电子剂量冷冻电镜技术清楚地剖析了HBF的晶体学结构，发现HBF具有长程有序的1D孔道结构。随后，研究人员通过激光共聚焦显微镜（CLSM）、氮气吸附等温曲线和红外光谱等系列手段证实BSA在框架内的均匀分布。

研究人员对氢键杂交框架的组装机理进行了详尽的研究。DFT计算证明蛋白质表面丰富的氨基酸残基可作为氢键给体，诱导H4TBAPy配体在蛋白质表面聚集。此外，红外光谱和固体紫外吸收光谱数据均证明蛋白质和配体形成了氢键作用。随后系统的实验还证实组装的驱动力主要来源于蛋白质表面的氨基与H4TBAPy羧基基团形成的氢键作用。值得注意的是，这种新型的蛋白质导向氢键组装策略可适用于细胞色素c (Cyt c)、辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶(CAT)、肌红蛋白(MB)、胃蛋白酶、葡萄糖氧化酶(GOx)、卵清蛋白(OVA)和转铁蛋白(TRF)等多种不同表面化学性质的蛋白质的组装。

图1. 蛋白质导向氢键杂交框架的设计及表征

蛋白质在框架内的分散性

研究人员通过跟踪不同组装阶段的形貌演变，进一步阐明蛋白质驱动的组装过程。为了探究蛋白质在框架内的分散性，研究人员采用温和的仿生矿化策略给BSA标记上金纳米簇（BSA-AuNCs），并通过TEM和HAADF-STEM清楚地观察到BSA-AuNCs在框架内的均匀分布，侧面论证了蛋白质的单分散性。此外，通过SAXS及Guinier拟合发现氢键杂交框架内形成半径约4.8 nm的介孔结构（仅供容纳1个BSA分子），进一步验证了蛋白质的单分散性。

图2. 蛋白质在框架内的分散性

组装策略的拓展

接下来，研究人员试图探索使用其他有机连配体和蛋白质构建生物杂交框架的可能性，旨在进一步提高杂交框架的蛋白质含量。通过理论计算（结构的pKa值）发现有机配体的π共轭体系增大，会促进配体中羧基的去质子化作用。可以设想，若采用更大的π共轭体系的配体作为组装模块，必然需要更多的蛋白质“模块”作为氢键供体，驱动组装。考虑到这一点，研究人员选择不同π共轭程度的四羧酸配体（H4PTTNA和H4TCBP）作为组装模块。实验发现配体的共轭体系越大，得到的杂交框架的蛋白质含量越高；同时，蛋白质在框架中束缚也越紧密。重要的是，在以H4PTTNA为配体的杂交框架中，BSA的含量高达67.4%（W/W），是目前报道的蛋白质框架复合材料的最高值。

图3. 组装策略的拓展

构建高活性的酶微型反应器

生物催化具有独特的底物选择性和极高的催化效率和反应速度，比化学催化反应的催化效率可高2-4个数量级。构建多孔载体固定的酶纳米反应器是提高生物催化效能的常用策略。鉴于这种组装策略的普适性，研究人员利用细胞色素c （Cyt c）、辣根过氧化物酶（HRP）和半乳糖苷酶（Gal）等酶分子作为组装模块，设计了系列高活性的酶@HBF微型反应器。酶@HBF具有1D有序的介孔通道、超高的酶含量及稳定的框架结构（pH=2-11下结构均稳定）。这种优异的建筑结构使酶@HBF反应器相比于先前报道的酶@ZIFs反应器，展示出更优异的酶催化效率。同时，相比于游离的酶分子，坚实的框架结构赋予酶@HBF更高的稳定性及优异的循环利用性。

图4. 高活性酶框架的设计及催化性能提升

结论与展望

本研究提出一种新型的蛋白质导向、氢键组装策略，构建高度结晶的生物杂交框架·；并系统揭示了氢键组装策略在蛋白质材料设计的巨大潜力。这种温和的组装策略可将脆弱的生物大分子和有机小分子高效地整合成结构稳定的材料体素，为纳米蛋白质超级结构的设计提供了新思路。我们相信这种蛋白质杂交框架在生物传感、催化、蛋白质递送和生物医药等领域均具有广泛的应用前景。

作者简介

陈国胜

副教授

中山大学化学学院副教授、硕士生导师。主要从事新型（生物）功能材料的设计及其在生命分析、传感等方面的应用研究。在Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Funct. Mater.、Chem. Sci.、Anal. Chem..等期刊上发表论文超过40篇，总引700多次，H指数17。

欧阳钢锋

教授

博士，教授，博士生导师，英国皇家化学会会士，国家杰出青年科学基金获得者，科技部中青年科技创新领军人才，广东省“珠江学者”特聘教授。现任中山大学化学与化学工程学院环境化学研究所所长，微萃取与分离技术研究中心主任，环境与能源化学广东省高校重点实验室副主任。主要从事环境分析化学、微萃取技术基础理论与应用等方面的研究。具体研究方向包括：环境原位采样技术；基于扩散控制的固相、液相微萃取校正技术基础理论研究与应用；活体采样技术及定量；基于新型纳米材料和介孔材料固相微萃取探针的制备与应用等。在Chem. Rev.、Nat. Commun.、Chem. Sci.、Anal. Chem.、Environ. Sci. Technol.等国际刊物上共发表SCI论文80余篇(影响因子3.0以上50余篇)，论文被SCI他引1500多篇次；编著《固相微萃取-原理与应用》一书，获邀参编英文专著三部；国家发明专利授权3项。

相关论文信息

▌论文标题：

Protein-directed, hydrogen-bonded biohybrid framework

▌论文网址：

https://www.cell.com/chem/fulltext/S2451-9294(21)00359-4

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.chempr.2021.07.003

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