全球首个人类椎间盘单细胞图谱发布，为椎间盘退行性疾病的治疗提供新线索

椎间盘退行性疾病（DDD）是引起颈肩痛与腰腿痛的主要原因，严重影响患者的生活质量，给家庭和社会造成了沉重的负担。

因此，科学家不断深入探索椎间盘生理学和病理学机制，寻求重建椎间盘稳态的创新治疗方法。然而，椎间盘细胞的高度异质性以及微环境的高度复杂性，为椎间盘退变生理病理机制的探索带来了重大挑战。

以往研究发现，人类椎间盘具有细胞多样性，且与多种生理病理事件密切相关。例如，椎间盘干细胞可能在椎间盘发育、损伤和修复过程中发挥关键作用。但迄今为止仍难以精确解析人类椎间盘内各细胞亚群的分子特征，起源及其调控机制。

近日，陆军军医大学陆军特色医学中心（大坪医院）骨科刘鹏课题组联合解放军总医院第五医学中心刘兵课题组，在陆军特色医学中心（大坪医院）陈林课题组的支持下，在Bone Research杂志上以封面论文的形式发表了重要研究成果。

研究人员对108108个椎间盘髓核、纤维环及终板组织的细胞分别进行了单细胞转录组测序和分析，系统绘制了人类椎间盘的单细胞图谱。这项研究让我们对椎间盘细胞异质性有了全新的认识。

此外，研究人员还根据细胞外基质（ECM）稳态的特征差异对软骨细胞亚群进行了重新分类。在这个基础上，研究人员结合体外功能实验发现了一群定位于髓核内部，特征性表达PDGFRA和PROCR的髓核祖细胞（NPPC），并揭示该细胞具有自我更新和三系分化能力。

据了解，这项工作是国际上首次针对人类椎间盘细胞异质性的系统研究，对于深入理解人类椎间盘发育及退变机制具有重要意义。

图1. 人类椎间盘的单细胞转录组全景图

研究人员从13-31周岁的研究人群中获得健康椎间盘（Pfirrmann I级），从中分离髓核、纤维环和终板组织，分别进行高通量单细胞转录组测序。

通过整合分析鉴定得到9个主要细胞亚群，包括：3群软骨细胞亚群、脊索细胞、基质细胞、周细胞、内皮细胞、祖细胞及血细胞，并利用已知基因标志物解析了它们在椎间盘的空间分布情况以及转录调控特征。

同时，研究人员对基质细胞进一步细分后发现，神经细胞和成骨细胞亚群也存在于髓核内部。

此外，研究人员还发现虽然椎间盘细胞以脊索谱系来源细胞为主，但是非脊索谱系来源的稀有细胞亚群可能对椎间盘的生理功能发挥着重要的支持作用。而且这两类细胞之间存在密切的细胞相互作用，诸多重要的生长因子相关信号通路如FGF、TGF、BMP、PDGF等参与其中。深入研究发现，这些椎间盘细胞亚群具有跨物种的高度保守性，在大鼠椎间盘中也可发现类似的细胞分群。

图2. 椎间盘内部细胞相互作用网络

根据细胞外基质的特征差异，研究人员将3群软骨细胞进一步鉴定为调控型、稳态型和效应型。其中，调控型软骨细胞主要在细胞因子表达和软骨生成相关调控通路中发挥调控作用；稳态型软骨细胞亚群相对静息并且分化完全，高度表达与基质合成和节律调节相关的基因；效应型软骨型细胞具有高代谢活性，并且高表达保护软骨的PRG4基因。

软骨细胞亚群在胞外基质稳态维持功能中的异质性，为进一步探索椎间盘软骨细胞的机制提供了一个新的视角。

研究人员还发现，祖细胞亚群主要存在于髓核组织中，而且特异性高表达间充质祖细胞标记物PDGFRA和中胚层来源间充质标志物PRRX1，这提示髓核内可能存在具有干性潜能的细胞群体。

进一步深入分析，发现了其中一个髓核祖细胞亚群高度表达干性基因PROCR，并富集了软骨生成相关的重要转录因子SMAD3。随后的免疫荧光染色也证实了PROCR+细胞内p-SMAD3高度活化。

最后，研究人员运用细胞表面标志物PROCR+分选富集了髓核祖细胞群体，并发现该细胞群具有较强的体外克隆形成能力。Monocle 3拟时序分析提示PROCR+细胞具有成骨和成软骨分化潜能，体外实验证实PROCR+细胞具有成骨、成软骨和成脂三系分化能力。

图3. 髓核祖细胞（NPPC）的特征和功能鉴定

综上，该研究首次绘制了人类椎间盘单细胞图谱，从空间上解析了细胞异质性和维持椎间盘稳态的关键分子事件，在单细胞水平上更新了对人类椎间盘的理解和认识，从转录组和功能学层面鉴定得到一群全新的髓核祖细胞（NPPC），为建立椎间盘退行性疾病的全新治疗策略提供了重要线索。

图4. 基于人类椎间盘细胞图谱发现的多种软骨细胞亚群及全新的髓核祖细胞

这项研究得到了陆军特色医学中心军事医学培养计划、国家自然科学基金委、重庆市博新计划、创伤烧伤与复合伤国家重点实验室多个基金项目的资助，陆军军医大学陆军特色医学中心（大坪医院）骨科刘鹏教授与解放军总医院第五医学中心刘兵研究员为该论文的共同通讯作者，甘翼搏博士后与贺健博士为论文的共同第一作者，陆军特色医学中心为第一完成单位。该工作也得到了陆军特色医学中心陈林教授课题组的参与和支持。

参考文献：

Gan, Y., He, J., Zhu, J. et al. Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs. Bone Res 9, 37 (2021). https://doi.org/10.1038/s41413-021-00163-z

责任编辑丨BioTalke

原标题：《全球首个人类椎间盘单细胞图谱发布，为椎间盘退行性疾病的治疗提供新线索》

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