CCS Chemistry | 基于理论计算精确设计DNA酶，催化活性媲美蛋白酶

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南京大学鞠熀先、周俊团队与荷兰阿姆斯特丹自由大学Célia Fonseca Guerra教授合作，利用理论计算对G4/hemin DNA酶的催化中心结构进行理性设计。在对G4/hemin DNA酶催化机制深刻理解的基础上，大幅度地提高了DNA酶活性。所设计的DNA酶在天然蛋白酶的最适条件下，已经达到和天然蛋白酶同等数量级的活性。

酶是具有催化功能的生物大分子，主要包括蛋白酶（Protease）和核糖核酸酶（Ribozyme）。自发现RNA具有催化活性后，学术界一直在探索DNA的催化功能，即脱氧核糖核酸酶（DNAzyme）。在当前所研究的DNA酶中，G-四链体（G4）/血红素（hemin）DNA酶是颇受重视的“明星”。G4具有稳定性高、构象丰富、可设计性强、生物相容性好等优点，且在生命体中广泛存在，因而倍受关注。虽然G4/hemin DNA酶在生命分析化学、核酸纳米技术等领域应用广泛，但是受限于催化活性低、机理不清等瓶颈问题，近些年研究进展和应用拓展相对缓慢。

针对上述科学问题，南京大学鞠熀先、周俊团队基于对G4结构的深刻理解（J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 7768-7779），通过调变G4结构以优化DNA与hemin相互作用的微环境，提高了G4/hemin DNA酶活性（Chem. Eur. J., 2017, 23, 4210-4215；ACS Catal., 2018, 8, 11352-11361；Chem. Commun., 2020, 56, 1839-1842），并依此构建了嗜热型高活性DNA酶（Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 16636-16640）。

最近，该团队基于前述研究积累，受辣根过氧化物酶（HRP）“push-pull” 催化机制的启发，与荷兰阿姆斯特丹自由大学Célia Fonseca Guerra教授合作，利用理论计算对G4/hemin DNA酶的催化中心结构进行理性设计。在对G4/hemin DNA酶催化机制深刻理解的基础上，大幅度地提高了DNA酶活性。研究发现，所设计的DNA酶在天然蛋白酶的最适条件下，已经达到和天然蛋白酶同等数量级的活性。

图1. G4/hemin DNA酶催化模型以及所设计的G4序列

首先，作者以序列F3TC（d[T2G3TG3TG3TG3TC]）为模型（图1a），通过理论计算发现，在3'末端胞嘧啶碱基（Cytosine, C）杂环碱基上引入了不同的化学基团（图1b），可以精确调节C碱基的电荷密度分布（图2b和2c）。然后，作者考察不同G4-DNA酶催化模型底物ABTS氧化形成ABTS·+的速率大小（图2a和2d），通过Michaelis−Menten方程获得不同DNA酶的米氏常数。理论计算和实验结果发现，不同的化学基团并不会明显改变C碱基上的电荷分布（图2b），只会在一定程度上影响C碱基上N3的电荷密度高低（图2c）。而该微弱的电荷密度变化却使DNA酶活性发生较大变化：从kcat值看，活性最高的F3T-azaC（kcat=25.39 ± 0.63 s-1）是F3T-pC（kcat=0.42 ± 0.02 s-1）的60.5倍。值得指出的是，文献中报道的HRP kcat值在50到800 s-1之间，说明设计所得的F3T-azaC DNA酶已经达到和天然蛋白酶同等数量级的活性。

图2. 不同C碱基衍生物的电荷密度及其DNA酶活性测量

接着，作者利用密度泛函理论（DFT）研究不同C碱基衍生物与H2O2之间的相互作用。结合实验结果，作者发现G4末端C碱基上N3的电荷密度越高，则C碱基与H2O2的结合力越强，所形成的DNA酶活性也会越高（图3）。作者还发现修饰之后的C碱基并不一定只和H2O2形成1：1的氢键网络，有可能会形成多个结合面，溶剂体系中的水分子也会与DNA酶体系发生作用而影响DNA酶活性。

图3. C碱基衍生物与H2O2的相互作用；N3电荷密度、C碱基与H2O2结合能大小和DNA酶活性大小之间的关系

作者进一步探究了C碱基激活DNA酶活性的机制，发现C碱基上的电荷密度的变化不仅影响了G4-DNA酶与H2O2的结合能力，而且决定了催化中间体化合物1的形成速率，最终实现了DNA酶催化活性的调节（图4）。

图4. 末端C碱基（及其衍生物）促进G4-DNA酶催化的机制

综上所述，作者基于对辣根过氧化物酶 “push-pull”催化机制的理解，通过理论计算与实验相结合，系统地研究了近端C碱基及其电荷密度在G4-DNA酶催化中的作用。发现末端G-平面中的G碱基可以充当His172的角色，而空间邻近的C碱基代替了His42，与铁中心H2O2结合，充分模拟了蛋白酶催化中心的微环境，从而实现了催化活性的显著增强。这一工作对促进G4-DNA酶在生命分析化学、核酸纳米技术的等领域的应用具有重要意义，也为最终实现DNA酶活性超越天然蛋白酶奠定了一定的基础。

该工作以research article的形式发表在CCS Chemistry，并已在“Just Published”栏目上线。此项研究得到了国家自然科学基金、中央高校基础科研经费、南京大学技术创新基金、南京大学队伍建设科研启动经费的资助。

文章详情：

A Push–Pull Mechanism Helps Design Highly Competent G-Quadruplex-DNA Catalysts

Jielin Chen, Jiawei Wang , Stephanie C. C. van der Lubbe, Mingpan Cheng, Dehui Qiu, David Monchaud, Jean-Louis Mergny, Célia Fonseca Guerra*, Huangxian Ju* & Jun Zhou*

Citation：CCS Chem. 2020, 2, 2183–2193

文章链接：https://doi.org/10.31635/ccschem.020.202000473

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原标题：《CCS Chemistry | 基于理论计算精确设计DNA酶，催化活性媲美蛋白酶》

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