《细胞》子刊：这一次，砒霜立大功了，可复活结构性突变的最强抑癌蛋白

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我怎么也没想到，古老的砒霜会在21世纪与最强抑癌蛋白p53相遇，而且还成为恢复突变p53抑癌能力的最强“潜力股”。

近日，由上海交通大学瑞金医院卢敏和牛津大学Xin Lu领衔的研究团队发现，砒霜（三氧化二砷，ATO）中的砷原子竟然能插入发生结构性突变、不能正常折叠的p53蛋白的DNA结合域，帮助突变p53蛋白折叠出有抑癌功能的三级结构[1]。

更重要的是，这项研究成果一举解决了困扰p53靶向药物开发的两大科学难题：无逻辑、无口袋。

换句话说，卢敏等的研究成果证实：一直被认为缺乏逻辑支撑的“通过靶向药物恢复突变蛋白活性”的思路，在p53蛋白上是可行的；一向被认为缺乏靶向药物结合口袋的p53蛋白，确实隐藏着一个不为人知的砷原子结合口袋。

总的来说，这是抑癌蛋白p53靶向治疗近40年来取得的重大突破，靶向治疗或由此迎来新一轮爆发。基于本研究成果的相关临床研究（PANDA-T0；NCT03855371），也在瑞金医院的主持下开展[2]。

相关研究成果发表在著名期刊Cancer Cell上，卢敏和Xin Lu是共同通讯作者，陈硕、Wu JiaLe、Liang Ying、Tang YiGang为共同第一作者。

▲ 本研究论文截图

小分子靶向治疗药物的诞生，改写了很多癌症的治疗范式。

然而，目前已经获批用于临床治疗的靶向药物覆盖的患者并不多。这在一定程度上是受靶向药物开发策略的影响。

我们都知道，在人体内有原癌基因和抑癌基因。原癌基因突变后，就会编码癌蛋白，诱发癌症；而抑癌基因突变，会导致抑癌蛋白失去抑制癌症形成和发展的能力。因此，从理论上讲，消除癌蛋白和恢复抑癌蛋白活性，都能用于癌症的治疗。

不过，事情并没有那么简单。

以各种各样激酶为代表的癌蛋白存在一个与ATP结合的口袋，只要开发相关药物，能占据或阻止ATP的进入，即可抑制癌蛋白的促癌活性。

而因突变失活的抑癌蛋白，开发药物的思路则完全是要反其道而行之：恢复抑癌蛋白的活性。这项拯救工作的难度有多大，从临床获批的药物就能看出来。投入临床使用的癌蛋白靶向药物已经有100多个了，而抑癌蛋白的靶向药物这一数据是0。

这背后的主要原因是：第一，恢复蛋白功能从逻辑上讲是极难实现的；第二，抑癌蛋白缺少让小分子药物结合的口袋。

尽管开发抑癌蛋白靶向药物难度极大，但还是阻挡不住科学家的热情。就拿p53这个抑癌蛋白来说，全球约50%的癌症患者发生突变。这也就意味着，从理论上讲，仅p53靶向药物就可用于治疗全球约50%的癌症患者，而目前已经获批用于临床治疗的100多个靶向抗癌药加在一起，也仅能用于2-13%癌症患者的治疗[3，4]。

▲ p53突变所占比例

也正是因为这个原因，p53成为迄今为止被研究的最多的蛋白[5]。

科学家们的努力也没有白费。

现在我们已经知道，由393个氨基酸组成抑癌蛋白p53包括3个功能域：发挥转录激活作用的N端功能域；帮助p53定位的C端功能域；以及位于中间的DNA结合域（DBD）[6]。

p53的突变类型多样，有基因片段缺失、插入，点突变引起的错义突变等。不过，在所有突变类型中，占主导地位的还是点突变引起的错义突变，占比高达80%[6]。更重要的是，97%的点突变发生在DNA结合域[6]。

从结构上看，上述点突变对p53 和DNA相互作用影响的机制可以分成两类[7，8]：其中一些p53突变（如突变热点Arg248和Arg273处的突变）导致p53不能与DNA接触；而其余的许多突变则被称为结构性突变（如热点Arg175、Gly245、Arg249和Arg282处的突变），这些突变损害了p53的DNA结合域（DBD）结构，导致p53无法正常折叠，不能与DNA紧密结合，因此丧失了抑癌能力。

▲ 不难看出，p53突变不仅主要分布在DBD区域，而且异质性非常高

实际上，在过去的几十年里，科学家已经发现了很多有拯救p53突变潜力的先导化合物[9，10]，只不过这些化合物恢复p53功能的效率比较低。

尽管如此，卢敏和他的同事还是认真研究了这些化合物的特点。他们注意到这些化合物都有一个有趣的特点，即能够结合半胱氨酸的硫醇基团[9，11]。

基于此，他们进一步假设，当p53的DNA结合域被结构性突变损害时，那些能够结合多个半胱氨酸的化合物或许可以稳定p53，恢复p53的抑癌活性。他们还推测，通过这种方法，或许能找到拯救p53结构性突变的通用化合物，而这些突变合计占所有p53突变的一半以上。

▲ 假想的候选化合物可能的结合位点

有了上述假设之后，卢敏团队就开始着手筛选能与2个及以上半胱氨酸结合的小分子。最后通过5个具有p53结构性热点突变的细胞系（R175H等）实验，从DTP数据库的20861个小分子[12]中筛选到4个化合物。

▲ 筛选到的4个化合物结构

通过优先识别折叠p53蛋白的抗体PAb1620检测，研究人员发现，砒霜和KAsO2对有R175H结构性突变p53蛋白的折叠存在惊人促进作用。简单地说，就是砒霜能恢复有R175H结构性突变p53蛋白的抑癌活性。而另外两种化合物的这种活性则要弱的多。

随后研究人员用另外4个不同的p53结构性突变细胞系检验了砒霜的效果，用PAb1620抗体检测发现，竟达到了野生p53蛋白的水准。

剂量研究表明，仅需低至0.1μg/mL的砒霜，就足以促进结构性突变p53蛋白在给药的15分钟之后正确折叠。

总的来说，研究人员通过多级筛选研究，确定了含砷化合物能有效地重新激活最常见的p53结构性突变体。

随后的研究发现，砒霜是通过共价结合稳定结构性突变的p53折叠。而且与之前发现的化合物，以及本研究中发现的其他化合物相比，砒霜的稳定作用远超其他化合物。

▲ 砒霜与其他化合物的共价结合比较

为了弄清楚砒霜恢复结构性突变p53的机制，卢敏团队10余位成员又花费近6年时间完成了p53-砷共结晶结构的解析，明确了p53功能复活的机制[13]。总的来看，p53-砷复合物与已公布的p53 DBD结构重叠性良好。

具体来看，砷与DNA结合域的Cys124、Cys135和Cys141相互作用，与此同时，Met133的侧链朝向砷，并与砷原子之间存在范德华相互作用。正是DNA结合域中的这4个氨基酸残基，搭建了一个可以与砷原子结合的口袋。

▲ 砷原子结合口袋全貌

由于p53本质上是一个转录因子，因此检验结构性突变p53功能恢复的办法之一是检测转录的激活状况。研究结果显示，砒霜能介导所有携带结构性突变p53的测试细胞系转录重新激活，而对于影响p53与DNA接触的突变类型，砒霜则没有激活的作用。

既然如此，砒霜的抗癌效果究竟如何呢？

卢敏团队随后在CDX和PDX小鼠模型上探索了砒霜的抗癌效果。砒霜的使用剂量是5mg/kg，这个剂量在小鼠中产生0.05-0.2μg/mL 砷血浆浓度，在砒霜治疗的急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中可以达到，而且不会产生严重的毒性[14，15]。

血液肿瘤的研究显示，砒霜显著延长了小鼠的中位生存时间，而实体瘤研究也显示，小鼠的肿瘤体积仅为对照组的10%左右。

以上的研究表明，砒霜确实有强烈的抑癌作用。

▲ 血癌（上）和实体瘤（下）的研究结果

而且与一线化疗药物顺铂的比较显示，砒霜对非小细胞肺癌的抑制作用与顺铂相似。

分析背后的作用机制发现，在砒霜处理的PDX肿瘤中检测到p21的上调，而在顺铂处理的PDX肿瘤中没有检测到。

相比之下，与对照组相比，顺铂处理的肿瘤中DNA损伤标志物表达的增强更为强烈，而砒霜处理的肿瘤中没有。

这也意味着顺铂和砒霜的抗癌机制并不相同，而且砒霜抗癌的原因至少有部分是因为重新激活了结构性突变的p53蛋白。

▲ 顺铂（CIS）和砒霜（ATO）的比较

在研究的最后，卢敏团队成员探讨了另一个重要的问题：砒霜的适用范围究竟有多大。

于是他们挑选了25个最常见的p53突变，它们都位于DNA结合域，且占到了癌症中p53错义突变的40.87%。其中18个是结构性突变，另外7个是DNA接触性突变。

▲ 25个突变的分布

总的来看，大部分结构性突变的p53被砒霜拯救，只是程度不尽相同。而DNA接触性突变p53，则没有被砒霜拯救。

随后的细胞系研究也证实，砒霜对具有结构性突变p53的癌细胞系显示出明显更强的杀伤力。

▲ 砒霜的不同类型突变细胞系研究

总的来说，卢敏团队的研究非常有系统性，确定了砒霜恢复结构性突变p53抑癌功能的潜力。这个研究还一举解决了困扰p53靶向药物研发的两大科学难题，证明了靶向抑癌蛋白确有其逻辑，而且也存在小分子化合物结合的口袋。

▲ 本研究主要内容总结

由于砒霜已被我国科学家开发成为治疗APL的药物，因此将其开发成p53突变癌症的治疗药物有大量的临床经验可以借鉴，这无疑会加快其临床开发速度。好消息是相关的临床研究已经开展。

更重要的是，这个研究提出了抑癌蛋白靶向治疗的思路，或将开启靶向治疗新时代。

参考文献：

[1].Chen S, Wu J L, Liang Y, et al. Arsenic Trioxide Rescues Structural p53 Mutations through a Cryptic Allosteric Site[J]. Cancer Cell, 2020.

[2].https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03855371

[3].Prasad V. Perspective: The precision-oncology illusion[J]. Nature, 2016, 537(7619): S63-S63.

[4].Tannock I F, Hickman J A. Limits to personalized cancer medicine[J]. The New England journal of medicine, 2016, 375(13): 1289.

[5].Dolgin E. The most popular genes in the human genome[J]. Nature, 2017, 551(7681): 427-432.

[6].李大虎, 张令强, 贺福初. 突变体p53研究进展[J]. 遗传, 2008(06):697-703.

[7].Cho Y, Gorina S, Jeffrey P D, et al. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations[J]. Science, 1994, 265(5170): 346-355.

[8].Joerger A C, Fersht A R. Structural biology of the tumor suppressor p53[J]. Annu. Rev. Biochem., 2008, 77: 557-582.

[9].Joerger A C, Fersht A R. The p53 pathway: origins, inactivation in cancer, and emerging therapeutic approaches[J]. Annual review of biochemistry, 2016, 85: 375-404.

[10].Levine A J. Targeting therapies for the p53 protein in cancer treatments[J]. Annual Review of Cancer Biology, 2019, 3: 21-34.

[11].Olivier M, Hollstein M, Hainaut P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use[J]. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(1): a001008.

[12].Shoemaker R H. The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen[J]. Nature Reviews Cancer, 2006, 6(10): 813-823.

[13].http://www.sih.org.cn/news.asp?id=1606

[14].Hu J, Liu Y F, Wu C F, et al. Long-term efficacy and safety of all-trans retinoic acid/arsenic trioxide-based therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(9): 3342-3347.

[15].Zhu H H, Wu D P, Jin J, et al. Oral tetra-arsenic tetra-sulfide formula versus intravenous arsenic trioxide as first-line treatment of acute promyelocytic leukemia: a multicenter randomized controlled trial[J]. J Clin Oncol, 2013, 31(33): 4215-4221.

本文作者 | BioTalker

汝之砒霜，彼之蜜糖

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