人多能干细胞诱导的类器官可作为肝脏疾病模型

原创 医学参考报 干就有未来

撰文│杨羊 何志颖

编辑│陈圆圆

审校│汤红明

新加坡基因研究所Yun-Shen Chan课题组开发了一种培养肝脏类器官的新方法，该肝脏类器官可在体外模拟药物诱导的胆汁淤积，并可用于模拟与非酒精性脂肪肝进展密切相关的胆管网络和胆管反应丧失。

据【《Gastroenterology》 2020年10月报道】题：人多能干细胞诱导的类器官可作为肝脏疾病模型（作者Yun-Shen Chan等）

肝脏是调节多种复杂代谢过程的器官，肝病的研究由于缺乏能完全重述复杂疾病表型的肝脏模型而受阻。现有的小鼠模型不能完全阐述人类肝病的发病机制和药物反应，而人原代肝细胞或多能干细胞(PSCs) 分化的肝细胞样细胞缺乏细胞间的相互作用和器官结构。类器官模型可表现出器官特异性的结构和功能，并模拟体内疾病表现，避免物种特异性差异，是人类疾病建模的理想选择。此前已有报道，可由人诱导多能干细胞(iPSCs)和成体肝干细胞生成肝类器官，然而这些类器官并不具备肝脏的结构特征，如胆管网络等，而且疾病建模仅限于不同肝细胞类型的功能方面，尚未发挥多细胞类器官在模拟全身反应中的所有潜力。

新加坡基因研究所干细胞与再生生物学系的Yun-Shen Chan课题组找到了一种分步、化学定义、高产量的方法，能够在96孔板的每个孔中生成单个肝类器官（HO）（步骤如图）。课题组利用这种独特的肝脏类器官结构，在体外模拟药物诱导的胆汁淤积，并进一步证实该HO可用于模拟与非酒精性脂肪肝(NAFLD)进展密切相关的胆管网络和胆管反应丧失。

课题组构建了一种人胚胎干细胞（hESCs）生成HOs的方法。生成的该HOs核心是ALB+肝细胞，周围被CK7+胆管细胞包裹。进一步对HOs分化不同阶段的细胞及人肝组织进行RNA测序，表明HOs不同于中间态的祖细胞，而与肝脏组织更相似。随后检测HOs分泌肝脏重要稳态蛋白的能力，发现HOs大量分泌白蛋白和载脂蛋白B。培养基中检测到ALP和GGT表明HOs中的胆管细胞表现出胆管活性。这些结果表明，课题组已经成功诱导出包含功能性肝实质细胞类型的HOs。

肝脏的主要功能是产生和分泌胆汁酸，胆汁酸由肝细胞产生，通过表面转运体分泌到胆管网络，随后转运到胆管。胆管网络是由极化的肝细胞之间连续紧密的连接形成。为了探究生成的HOs是否能够重述肝脏的胆管网络，需要证实HOs中肝细胞确实表达紧密连接蛋白以及主要的胆汁转运体。以人原代肝细胞球作为对照，采用荧光化合物CDF进行活体成像，可在HOS中看到一个稳定的胆管网络形成，而原代肝细胞中只看到CDF通过球转运进入极少数肝细胞之间的连接处。分化36天后，HOS中积累的CDF可分泌到广泛的胆管网络中。这些结果证明HOs中存在一个从肝细胞连接到胆管细胞囊肿结构的功能性胆管网络。总之，课题组的方案有效生成了HOs，满足定义类器官的3个标准：①包含器官的多个细胞类型；②在器官中形成结构特征；③执行器官的功能。

观察到的胆管系统为使用HOs来研究肝内胆汁淤积症提供了机会。使用曲格列酮可诱导胆汁淤积性肝损伤，当HOs与曲格列酮孵育一周时，细胞凋亡和ALT水平增加，表明此HOs可以重述由曲格列酮引起的肝损伤。通过CDF活体成像发现曲格列酮孵育的HOs中CDF有明显积累，胆管网络明显中断和丢失。这些结果表明此HOs可用于研究肝内胆汁淤积症。

课题组还设计了一系列实验探究此HOs是否可用于模拟NAFLD。课题组利用游离脂肪酸（FFA）混合物孵育成熟的HOs(FFA-HOs)，经过孵育的HOs易形成脂滴，脂质积累的细胞数量和总甘油三酯随时间增加而增加。为了阐述高FFA环境下HOs的特征，课题组使用RNA测序对其进行总基因表达谱分析，发现FFA-HOs中脂质和碳水化合物代谢基因表达明显增加。此外，为了研究FFA-HOs的分子特征是否类似于体内NAFLD的发展，课题组对所有HOs和多个非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的肝组织样本进行了无偏差比较，发现HOs的基因表达变化可以重述NASH患者组织的变化。最后，课题组确定了一系列在NASH患者和FFA-HOs中普遍失调的基因，其中一些基因在NAFLD进展中发挥了作用。这些结果表明可以使用此HOs在体外模拟NAFLD。

课题组的HOs独特的细胞组成可以研究与NAFLD纤维化进展密切相关的胆管反应，其特征包括门脉三联症中胆管周围的CK7+胆管细胞数量增加，迄今还没有体外模型研究这种NAFLD表型。课题组从FFA-HOs和病人组织的转录谱中寻找胆管反应的证据，发现胆向基因明显上调和肝向基因下调，FFA-HOs中CK7+细胞增多和ALB+肝细胞减少。CDF实时成像表明FFA-HOs中的胆管网络被破坏，胆管长度下降，网络连接性也延迟。

本研究首次表明肝向细胞和胆向细胞可以来源于肝母细胞并聚集形成功能性胆管系统。与其他报道的类器官不同，该方案可以高通量生成形状、大小和结构一致的HOs，成功重述肝脏的胆管网络。此HOs可用来模拟肝内胆汁淤积症，是研究药物相关肝毒性的补充资源，其独特的细胞组成和结构特征在模拟NAFLD进展和剖析其病理机制方面也将大有所为。

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